【求助】脑组织免疫荧光，大家帮我分析一下

冰冻切片 30微米，漂片法

1 0.3％Trition-100＋2％BSA 1小时 室温 洗3次，每次5分钟
2一抗＋3％山羊血清 4度 30小时 洗3次，每次5分钟
3 二抗3小时， 洗3次，每次5分钟
4 封片
看看结果，是不是背景太亮了，不大家帮我分析一下原因。

而且0.3％Trition-100孵育的时间是不是长了点。
这个是10倍的
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这个是20倍的
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减少背景色的方法一般是，封闭液封闭以后再加抗体，增加一抗孵育时间，最好是4度湿盒过夜，另外我个人觉得你透膜的方法好像有问题，我的方法是0.5%Triton孵育20min就可以了，还有就是我的抗体都是用抗体稀释液进行稀释的，抗体稀释液由0.5%Triton+0.05%NaN3+5%normol goat serum溶于PBS配制，封闭液由1%BSA 4%goat serum 用PBS配制。

能不能把你的步骤再具体介绍一下，谢谢。
再有，抗体稀释液是一抗二抗都用这个稀释吗，NaN3是什么。而且稀释液中为什么加Trition
封闭液封闭多长时间。

1)4将切片用PBS清洗2次，每次10 min
2）0.5%Tritonx-100孵育20min，以达到充分破膜，然后PBS清洗标本2次，每次10min
3)封闭液封闭30min
4)滴加特异性一抗，4度湿盒过夜，PBS清洗2次，每次10min
5)滴加二抗，室温孵育30min，PBS清洗标本2次，每次10min
6)封片剂封片，荧光显微镜下观察。
所需液体：
1)TritonX-100 用PBS配置成5%的储存液，4度保存，每次用以前再稀释
2)抗体稀释液 PBS10ml 0.3%TritonX100 0.05%NaN3 5%正常用羊血清
3)封闭液 1%BSA 4%羊血清 10mlPBS
4)封片剂 甘油: 去离子水==7:3
由于我们经过了破膜和封闭，所以抗体稀释液里面可以不用加Triton NaN3是叠氮钠，主要是防腐以及保持组织新鲜度，封闭液主要是是封闭未吸附蛋白的部位,以减少非特异性结合背景的影响，也就是减少背景色。

不知道回答的详细否，免疫组化需要摸索条件，从孵育时间到抗体浓度在不同实验室不同组织会有很多差别，希望对你有所帮助。

太感谢了，你也做脑片吗，你的片子厚度是多少

是在郁闷啊，我的免疫荧光也是问题多多。DAB染的很好，但荧光却染不上，到底是什麽原因啊
我的方法是：
1)将切片用PBS清洗2次，每次10 min抗原高压修复，PBS洗
2）0.5%Tritonx-100孵育20min，以达到充分破膜，然后PBS清洗标本2次，每次10min
3)封闭液封闭30min
4)滴加特异性一抗，4度湿盒过夜，PBS清洗2次，每次10min
5)滴加二抗，室温孵育30min，PBS清洗标本2次，每次10min
6)封片剂封片，荧光显微镜下观察。
哪位专家/高手请不吝赐教！！

jasmineliuxin
你也做脑组织吗，片子切的是多厚。你的封闭时间是不是能够延长一点。比如5小时，也许效果会好一点。

我也是在做脑冰冻切片免疫荧光，很高兴和大家一起学习探讨
我的方法如下：
一、冰冻切片的制作
1.大鼠心脏灌注，先生理盐水15分钟，然后4％ PFA 15分钟，取下大脑。
2.4％PFA，30％ 蔗糖沉底（24－48小时）
3.－80度冰冻，第二天恒冷箱切片（－20度），厚度10微米
二、免疫荧光染色
1、PBS浸泡5分钟
2、0.3％Triton 破膜 30分钟
3、BSA封闭 10－15分钟
4、单抗GFAP孵育，－4度 过夜
5、PBS 洗3×10分钟
6、FITC二抗 37度半小时－1小时
7、PBS 洗3×10分钟
8、DAPI染核 2分钟
9、PBS 洗3×3分钟
10、50％甘油封片
11、荧光显微镜观察，拍照
GFAP如图

怎么突然不可以穿jpg啊，郁闷

再试试
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挺好的，染上了。

我想请教一下，0.3％Triton 破膜指的是什么，是细胞膜吗，是不是在其他组织比如肝脏，肌肉等也需要这个步骤？我用的是石蜡切片是不是也可以按照你上面说的程序来染色，有没有其他好的方法可以使背景色与荧光绿色更好的区分开，让组织结构清楚一点？谢谢

Triton 破膜是指在一定程度上破坏细胞膜，增加细胞膜的通透性。从而使一抗二抗等物质可以进入细胞。

我也在做脑冰冻切片的TH免疫组化,一直都做不出来,请各位帮我分析一下好吗?
1 小鼠处死,生理盐水灌流,4%PFA灌流,再置于4%PFA中后固定4度过夜,再以30%蔗糖脱水至下沉.
其中4%PFA和蔗糖都是用蒸馏水配制的
2 液氮10秒冷冻,切片厚度10微米,-20度保存
3 组化步骤
(1) 切片自冰箱取出,室温40分钟复温,PBS洗涤3次,每次5分钟
(2)0.3%TRITON 破膜,37度湿盒30分钟,PBS洗涤3次,每次5分钟
(3)5%山羊血清(0.3%TRITON-PBS稀释)封闭15分钟.不洗直接甩去
(4)一抗(博士德,兔抗鼠)1:100,湿盒4度过夜,PBS洗涤3次,每次5分钟
(5)二抗(中杉金桥,羊抗兔)1:50,37度湿盒1小时,PBS洗涤3次,每次5分钟
Hoechst 33258染核，室温１０分钟，PBS洗涤3次,每次5分钟
荧光显微镜观察，核染色明显，但ＴＨ无荧光，连我的正常脑组织切片即阳性对照也染不出来，非常苦恼，请各位指点！

To fengshm
作免疫组化的 4%PFA 和蔗糖不能用蒸馏水配制，应该用0.1M 的PB配制

我是菜鸟，不好意思！
请教各位：荧光染色或者激光共聚焦的片子可以用石蜡的做吗？
如果做双标，推荐什么二抗啊？
是不是一定要使用DAPI染核啊？
多谢前辈们！

antigen retrieal is important

there are a few ways to de-mask the antigen,

1) high temperature (80-100oC)
2) alkaline (pH 9-10)
3) acidic

antigen retrieal with sodium citrate (10mM, pH 9.0) at 80oC can help you hae good antigen de-masking

再次求教！请问我的实验方法是否有问题，到底是什么原因导致我没有荧光呢？

to fengshm

其中4%PFA和蔗糖都是用蒸馏水配制的
(for the preparation of 4 % PFA )
for example:
4% paraformaldehyde (in 0.1M PB pH 7.3) (make fresh)
500 ml water
40 gr paraformaldehyde
heat to 60-70 C, adjust with NaOH, and stir 10 minutes to dissole, add 500 ml 0.2M P.B. (final conc. 0.1M), filter and store at 4 degree (ready to use)
(for the preparation of 0.2M Phosphate Buffer, pH7.2)
for example: 16.6 gr Na2HPO4 7H2O
2.5 gr NaHPO4 H20
water to 400 ml

2 液氮10秒冷冻,切片厚度10微米,-20度保存
3 组化步骤

(1) 切片自冰箱取出,室温40分钟复温,PBS洗涤3次,每次5分钟 after this, then antigen retrieal before you perform the next steps: 10mM sodium citrate (pH 9.0) at 80oC 30min, cool down to RT, then continue
(2) 5%山羊血清(0.3%TRITON-PBS稀释)封闭 and penetrate for 1 hour.不洗直接甩去
(4)一抗(博士德,兔抗鼠)1:100,湿盒4度过夜,PBS洗涤3次,每次5分钟 (why 1:100, hae you optimize the concentration of antibody )
(5)二抗(中杉金桥,羊抗兔)1:50,37度湿盒1小时,PBS洗涤3次,每次5分钟
DeilHoechst 33258染核，室温１０分钟，PBS洗涤3次,每次5分钟
荧光显微镜观察，核染色明显，但ＴＨ无荧光，连我的正常脑组织切片即阳性对照也染不出来，非常苦恼，请各位指点！

谢谢benature！我没作过抗原修复，不知道柠檬酸钠该怎么配，查了文献，好像多数是配成酸性的，PH6.0,对吗？还有抗原修复的详细步骤能告诉我吗？是用水浴锅还是要用微波炉呢？sodium citrate 是不是应该预热到80度，然后切片浸在其中，保温30min，自然降温到室温，PBS洗涤3次即可呢？不好意思，因为没做过，问题很多！