RNAi
2010-01-07 01:51:45 PM
请教Si RNA是什么咚咚？小分子干扰RNA可以沉默基因？
这方面一无所知，在肿瘤方面有应用前景吗？
转录后基因沉默（PTGS， post- transcriptional gene silencing）-最初被认为仅限于矮牵牛花和其它一些植物中的奇异现象，是目前分子生物学研究中一个最热门的话题。过去几年中，科研工作者已明确转录后基因沉默现象普遍存在于动、植物中，在机体防御病毒入侵和转座子沉默效应中起着重要作用。但是最激动人心的是转录后基因沉默现象的技术应用，即在多种有机体中应用核糖核酸干扰（RNA interfere ,RNAi）技术进行特异性的基因剔除以研究相应的基因功能。那么RNAi现象是如何被 10多年前，Rich Jorgensan和他的同事在矮牵牛花中发现一种奇怪的现象。他们尝试把由一强有力启动子控制的基因pigment-produing导入矮牵牛花以加深花的紫色，结果不但颜色未加深，许多花呈现杂色甚至白色。Rich Jorgensan把这种现象称为“共抑制”，因为外源性导入基因和内源性具有相似功能基因的表达都被抑制了。当时人们不知道这是一种转录后基因沉默。
Si RNA应该是small interfering RNA，小干涉RNA。
http://www.chinagene.cn/yc/qikan/manage/wenzhang/2003.3.27.pdf
这篇综述有介绍一些东西。
就是小干扰RNA,它现在在肿瘤方面的研究比较热
你可以上生物谷看看
1: Science. 2004 Aug 20;305(5687):1163-7. Epub 2004 Jul 29. Links
Gefitinib-sensitizing EGFR mutations in lung cancer actiate anti-apoptotic pathways.Sordella R, Bell DW, Haber DA, Settleman J.
Center for Molecular Therapeutics, Massachusetts General Hospital Cancer Center and Harard Medical School, Building 149, 13th Street, Charlestown, MA 02129, USA.
Gefitinib (Iressa, Astra Zeneca Pharmaceuticals) is a tyrosine kinase inhibitor that targets the epidermal growth factor receptor (EGFR) and induces dramatic clinical responses in nonsmall cell lung cancers (NSCLCs) with actiating mutations within the EGFR kinase domain. We report that these mutant EGFRs selectiely actiate Akt and signal transduction and actiator of transcription (STAT) signaling pathways, which promote cell surial, but hae no effect on extracellular signal-regulated kinase signaling, which induces proliferation. NSCLC cells expressing mutant EGFRs underwent extensie apoptosis after small interfering RNA-mediated knockdown of the mutant EGFR or treatment with pharmacological inhibitors of Akt and STAT signaling and were relatiely resistant to apoptosis induced by conentional chemotherapeutic drugs. Thus, mutant EGFRs selectiely transduce surial signals on which NSCLCs become dependent; inhibition of those signals by gefitinib may contribute to the drug's efficacy.
PMID: 15284455 [PubMed - indexed for MEDLINE]
2006诺贝尔医学奖述评
http://www.dxy.cn/bbs/post/iew?bid=116&id=7188022&sty=1#7188022
据英国媒体报道，瑞典皇家卡罗林医学院称，他们发现了控制基因信息流动的基本机制，因RNA干扰的发现而入选。RNA干扰是一个生物过程，在这个过程中双链RNA（double-strandedRNA）以一种非常明确的方式抑制了基因表达。自1998年发现以来，RNA干扰已经作为一种强大的“基因沉默”技术而出现。这项技术被用于全球的实验室来确定各种病症中哪种基因起到了重要作用。
法尔和梅洛于1998年正式发表论文，公布了有关ＲＮＡ干扰机制的发现。以他们的发现为基础，ＲＮＡ干扰技术近年来迅速兴起，其前景被普遍看好。
ＲＮＡ能够充当“信使”，传递ＤＮＡ（脱氧核糖核酸）上的遗传信息，将其用于蛋白质的生产合成。研究显示，向生物体内注入微小ＲＮＡ片段，会干扰生物体本身的ＲＮＡ“信使”功能，导致相应蛋白质无法合成，从而“关闭”特定基因。科学家认为，采用ＲＮＡ干扰技术直接从源头上让致病基因“沉默”，也许可以更有效地治疗某些疾病。
这种技术最初曾被用来研究植物和蠕虫等，科学家后来发现它对哺乳动物细胞也有效。例如，美国哈佛医学院的科学家已经成功地利用ＲＮＡ干扰技术治愈了实验鼠的肝炎。目前，ＲＮＡ干扰治疗技术正在快速进入人体试验阶段。一些公司正在资助用这项技术治疗黄斑变性、乙肝等疾病的试验。
不过，尚有几个难题阻碍着该技术的发展。首先，科学家还没有找到一种方便快捷的方法，使ＲＮＡ干扰能在患者体内的有效部位进行。比如说，在治疗黄斑变性时，科学家可以直接对患者眼部进行治疗，而对于其他一些疾病就没有这么简单。其次，科学家还无法确定这种疗法是否会影响目标基因以外的其他基因，引发副作用。
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http://www.cmt.com.cn/article/061012/a0610120301.htm
中国医学论坛报
RNA干扰:让致病基因沉默
——2006年诺贝尔生理学或医学奖颁予RNA干扰发现者
--------------------------------------------------------------------------------
Andrew Z. Fire 生于1959年,1983年于美国麻省理工学院获生物学博士学位,现任美国斯坦福大学医学院病理与遗传学教授。
Craig C. Mello 生于1960年,1990年于美国哈佛大学获生物学博士学位,现任美国马萨诸塞大学医学院分子医学教授。
2006年10月2日,瑞典卡罗琳斯卡研究院颁发了本年度诺贝尔生理学或医学奖,美国斯坦福大学医学院的Andrew Z. Fire和马萨诸塞大学医学院的Craig C. Mello因发现一种全新的基因调控方式——RNA干扰(RNAi)而获此殊荣。
他们发现,双链RNA会使与之同源的基因沉默,并将这种作用命名为RNAi。这种生化机制在细胞的基本活动中扮演着重要角色,植物、动物和人体组织中均可见到RNAi这种特殊的基因表达控制方式。RNAi可抵抗RNA病毒感染(尤其是在植物和无脊椎动物中),并可削弱跳跃基因[(jumping gene)即转座子(transponson)]对基因组的影响。现在该技术已经被广泛用于对基因功能的研究,并可能在未来发展成为一种新的治疗方法。
细胞中的信息流NA→mRNA→蛋白质
众所周知,DNA是多数生物的遗传物质,DNA中所包含的遗传信息首先将被准确无误地转录为mRNA,后者再通过核糖体将特定遗传信息翻译为相应的蛋白质,这种DNA→mRNA→蛋白质的基因信息流即为分子生物学的中心法则(图1)。
人类的基因组由约3万个基因组成,但对每个细胞而言,仅部分基因是有用的,换言之,仅部分基因需要表达。DNA→mRNA的转录过程是控制基因表达的关键步骤,此外,该过程还受到多种细胞因子的调控。在从细菌到人的漫长进化过程中,各种生物的基因表达均遵循了同样的原则,这个原则也是基因技术的根本,人们根据这项原理,将特定DNA导入细胞,以使细胞表达相应的产物。
上世纪90年代,部分植物学家试图向牵牛花的基因组中引入红色素基因,以使花瓣的颜色加深,结果却发现,花瓣的颜色非但没有加深,反而全部消失并变为白色。当时无人能解释这种现象的原因,直至Fire和Mello有了新的发现。为此,他们获得了今年的诺贝尔奖。
RNAi的发现
mRNA的编码链被称作“正义”链,与之互补的mRNA链则被称作“反义”链。Fire和Mello给秀丽隐杆线虫分别注射编码一种肌肉蛋白质mRNA分子的正义或反义链后,线虫的行为均未受任何影响,而当他们同时给线虫注射正义和反义mRNA时,线虫出现了奇特的颤搐运动,这种运动与完全缺乏肌肉蛋白功能基因的线虫相同,这说明什么呢?
正义和反义RNA分子会结合在一起形成双链RNA分子。通过一系列简单而巧妙的实验,Fire和Mello推论,双链RNA分子确可导致基因沉默,他们将这种现象命名为RNAi。RNAi仅能使与外源RNA分子编码相匹配的基因沉默,且这种作用可在细胞间传播,甚至被遗传(图2)。
RNAi机制——基因沉默
RNAi机制已被初步阐明:双链RNA会首先结合到一种蛋白质复合体(Dicer)上,后者会将其切割成片段,此后,另外一种蛋白质复合体(RISC)会与这些片段结合。有一条RNA链会被清除,而另外一条仍与RISC复合体结合的RNA链即成为探测mRNA分子的探针。当一条mRNA分子与RISC复合体上的RNA片段通过碱基配对的形式结合时,该mRNA分子便会被剪切并降解,其对应的基因也就沉默了(图3)。
RNAi——对抗病毒和跳跃基因的防线
RNAi可有效对抗双链RNA病毒,当这种病毒感染细胞时,只要将编码它们基因组RNA序列的双链RNA分子注入细胞,病毒RNA便会被降解,从而使细胞得以存活。现已证实,植物、蠕虫和果蝇体内均存在这种抗病毒机制,但尚未在脊椎动物(包括人)体内发现这种抗病毒机制。
跳跃基因是可在基因组中移动的DNA序列,所有生物体中均有跳跃基因的存在,当它们插入特定基因序列时即会直接影响该基因表达。很多转座子首先将他们的DNA序列转录为RNA,再反转录为DNA并插入基因组的任意位置,这些RNA分子通常部分形成双链,因此可因RNAi被遏制。从这个角度讲,RNAi保护了基因组。
RNAi调控基因表达
RNAi不仅是线虫基因调控机制的重要组成部分,也是人类基因表达调控的重要因素。人类基因组中有数百种基因编码一种被称作microRNA的小RNA分子,microRNA的序列中包含其他基因的编码片段,这些microRNA分子可形成双链结构,并通过激活RNAi来阻断特定蛋白质的合成。现已证实,microRNA介导的基因调控在生物体发育和细胞功能调控过程中均发挥着重要作用。
RNAi在医学领域的应用前景
RNAi技术开辟了基因研究的新篇章,研究者可设计双链RNA分子使特定基因沉默。已有研究者用RNAi技术成功使实验动物的一种可致血胆固醇水平升高的基因沉默,另有很多利用该技术治疗病毒感染、心血管疾病、肿瘤、内分泌疾病等多种疾病的计划正在酝酿之中。
http://www.ambion.com/
http://www.ambion.com/techlib/append/
http://www.ambion.com/techlib/Documents.html?fkResSxn=10&fkSubSxn=28
http://www.ambion.com/techlib/misc/psilencer_conerter.html
http://www.ambion.com/techlib/prod/
http://www.ambion.com/techlib/misc/ectors/2.0_U6.html#map
http://www.ambion.com/techlib/Documents.html?fkResSxn=7&fkSubSxn=23
（缩略图，点击图片链接看原图）
60个碱基以下一个碱基1.5元。
60个碱基以上一个碱基3元。
如果5OD再double。
Silencing of gene expression with small interfering RNA. Gene silencing by small interfering RNA (siRNA) technology uses a small double-strand RNA (i.e., the siRNA) that triggers degradation of target mRNA. High-purity control siRNA oligonucleotides that target the
sequence 5-AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3 were purchased from Qiagen (alencia, CA). This scrambled sequence does not match any human genome sequence. EGFR siRNA duplexes that target the sequences 5-AACACAGTGGAGCGAATTCCT-3 as described preiously
(22) was synthesized by Qiagen. SMARTpool COX-2 siRNA which contains four indiidual duplexes was purchased from Dharmacon (Lafayette, CO).
The following sequences were successfully made: siRNA-EGFR sense 5'-GGAGCUGCCCAUGAGAAAUdTdT-3' and antisense
5'-AUUUCUCAUG GGCAGCUCCdTdT-3'. The unrelated nonspecific dsRNAs as control were designed as following: sense 5'-GAACUUCAGGGUCAGCUUG CCdTdT-3' and antisense 5'-GGCAAGCUGACCCUGAAGUUCdTdT-3'. Single strand sense and antisense sequences were
annealed into dsRNA following the manufacturer's instructions. The annealed dsRNAs were confirmed on a 15% PAGE gel electrophoresis.
Epidermal growth factor receptor RNA interference. For transient inhibition of EGFR mRNA production, HL-deficient RCC cells were transfected with commercially aailable double-stranded 21-nucleotide-long small interfering RNA (siRNA) targeting the EGFR or a control siRNA (Ambion, Austin, TX). HL-deficient RCC cells were also stably transfected
to express one of two different shRNA sequences targeting the EGFR (30). For each sequence, two ssDNA oligonucleotides were synthesized (Initrogen) and subsequently annealed by incubation for 3 minutes at 90jC followed by 1 hour at 50jC. ssDNA were designed with oerhangs encoding restriction sites for BamHI/HindIII, and the annealed products were ligated directly into the pSilencer 3.1-H1 neo ector (Ambion). Sequence 1 (5-3): shRNA EGFR-1 forward GATCCAACTCTGGAGGAAAAGAAAGTTTCAAGAGAACTTTCTTTTCCTCCAGAGTTTTTTTTGGAAA
and
shRNA EGFR-1 reerse AGCTTTTCCAAAAAAAACTCTGGAGGAAAAGAAAGTTCTCTTGAAACTTTCTTTTCCTCCAGAGTTG.
Sequence 2 (5-3):
shRNA EGFR-2 forward GATCCAACACAGTGGAGCGAATTCCTTTCAAGAGAAGGAATTCGCTCCACTGTGTTTTTTTTGGAAA
and shRNA EGFR-2
reerse AGCTTTTCCAAAAAAAACACAGTGGAGCGAATTCCTTCTCTTGAAAGGAATTCGCTCCACTGTGTTG.
A pSilencer 3.1-H1 neo ector encoding random control shRNA was also purchased from Ambion. Stable clones were selected in neomycin containing medium. All transfections were conducted with Effectene transfection reagent (Qiagen, alencia, CA). All constructs were erified by standard DNA sequencing.
screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=375 height=305 title="Click to iew full 未命名.gif (375 X 305)" border=0 align=absmiddle>
设立阴性对照阳性对照。
---------------------------------------
Psilencer ，退火buffer。
-------------------------------------
学习提取质粒：
载体（两个酶切位点）
酶：体系（过夜、37度、H2O,酶，buffer）
电泳：两个片段
切胶回收：试剂
连接：（16度过夜，质粒：DNA 1：1－10）
转化：DH 5a 37度，过夜
挑克隆
挑质粒
酶切鉴定。
http://www.ambion.com/techlib/tn/101/4.html
http://proteas.uio.no/siRNAbeta.html
siRNA Calculator 1.0 beta
--------------------------------------------------------------------------------
Synopsis:
The program scans an input cDNA sequence in order to aid the process of designing short interfering RNA (siRNA) targeting new endogenous human genes. In addition to the input sequence, the user is asked to supply the preferred range of GC content and whether to accept the following absolute design criteria:
GeneCard for protein-coding EGFR GC07P054860
http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=EGFR&search=EGFR
http://www.genecards.org/cgi-bin/cardsearch.pl?search=EGFR&search_type=kwd&speed=fast&mini=yes
http://www.ncbi.nlm.nih.go/entrez/iewer.fcgi?db=Nucleotide&dopt=GenBank&al=63101669
http://www.ncbi.nlm.nih.go/entrez/query.fcgi?db=gene&cmd=Retriee&dopt=full_report&list_uids=1956
1: BC094761. Reports Homo sapiens epid...[gi:63101669] Order cDNA clone, Links
CommentFeaturesSequenceLOCUS BC094761 3859 bp mRNA linear PRI 28-JUL-2005
DEFINITION Homo sapiens epidermal growth factor receptor (erythroblastic
leukemia iral (-erb-b) oncogene homolog, aian), mRNA (cDNA clone
MGC:104637 IMAGE:30528231), complete cds.
ACCESSION BC094761
ERSION BC094761.1 GI:63101669
KEYWORDS MGC.
SOURCE Homo sapiens (human)
ORGANISM Homo sapiens
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; ertebrata; Euteleostomi;
Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Primates; Haplorrhini;
Catarrhini; Hominidae; Homo.
REFERENCE 1 (bases 1 to 3859)
AUTHORS Strausberg,R.L., Feingold,E.A., Grouse,L.H., Derge,J.G.,
Klausner,R.D., Collins,F.S., Wagner,L., Shenmen,C.M., Schuler,G.D.,
Altschul,S.F., Zeeberg,B., Buetow,K.H., Schaefer,C.F., Bhat,N.K.,
Hopkins,R.F., Jordan,H., Moore,T., Max,S.I., Wang,J., Hsieh,F.,
Diatchenko,L., Marusina,K., Farmer,A.A., Rubin,G.M., Hong,L.,
Stapleton,M., Soares,M.B., Bonaldo,M.F., Casaant,T.L.,
Scheetz,T.E., Brownstein,M.J., Usdin,T.B., Toshiyuki,S.,
Carninci,P., Prange,C., Raha,S.S., Loquellano,N.A., Peters,G.J.,
Abramson,R.D., Mullahy,S.J., Bosak,S.A., McEwan,P.J.,
McKernan,K.J., Malek,J.A., Gunaratne,P.H., Richards,S.,
Worley,K.C., Hale,S., Garcia,A.M., Gay,L.J., Hulyk,S.W.,
illalon,D.K., Muzny,D.M., Sodergren,E.J., Lu,X., Gibbs,R.A.,
Fahey,J., Helton,E., Ketteman,M., Madan,A., Rodrigues,S.,
Sanchez,A., Whiting,M., Madan,A., Young,A.C., Shechenko,Y.,
Bouffard,G.G., Blakesley,R.W., Touchman,J.W., Green,E.D.,
Dickson,M.C., Rodriguez,A.C., Grimwood,J., Schmutz,J., Myers,R.M.,
Butterfield,Y.S., Krzywinski,M.I., Skalska,U., Smailus,D.E.,
Schnerch,A., Schein,J.E., Jones,S.J. and Marra,M.A.
CONSRTM Mammalian Gene Collection Program Team
TITLE Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length
human and mouse cDNA sequences
JOURNAL Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26), 16899-16903 (2002)
PUBMED 12477932
REFERENCE 2 (bases 1 to 3859)
CONSRTM NIH MGC Project
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (06-MAY-2005) National Institutes of Health, Mammalian
Gene Collection (MGC), Bethesda, MD 20892-2590, USA
REMARK NIH-MGC Project URL: http://mgc.nci.nih.go
COMMENT Contact: MGC help desk
Email: cgapbs-r@mail.nih.go
Tissue Procurement: Dr. Stefan Hansson
cDNA Library Preparation: Michael Brownstein / Ted Usdin
Laboratory
cDNA Library Arrayed by: The I.M.A.G.E. Consortium (LLNL)
DNA Sequencing by: Sequencing Group at the Stanford Human Genome
Center, Stanford Uniersity School of Medicine, Stanford, CA 94305
Web site: http://www-shgc.stanford.edu
Contact: (Dickson, Mark) mcd@paxil.stanford.edu
Dickson, M., Schmutz, J., Grimwood, J., Rodriquez, A., and Myers,
R. M.
Clone distribution: MGC clone distribution information can be found
through the I.M.A.G.E. Consortium/LLNL at: http://image.llnl.go
Series: IRAK Plate: 198 Row: m Column: 16
This clone was selected for full length sequencing because it
passed the following selection criteria: matched mRNA gi: 41327737.
Differences found between this sequence and the human reference
genome (build 36) are described in misc_difference features below
and these differences were also compared to chimpanzee genome
(build 1).
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..3859
/organism="Homo sapiens"
/mol_type="mRNA"
/db_xref="taxon:9606"
/clone="MGC:104637 IMAGE:30528231"
/tissue_type="Placenta, normal"
/clone_lib="NIH_MGC_147"
/lab_host="DH10B"
/note="ector: pBluescriptR"
gene 1..3859
/gene="EGFR"
/note="synonyms: ERBB1, mENA"
/db_xref="GeneID:1956"
/db_xref="MIM:131550"
misc_difference 42
/gene="EGFR"
/note="'T' in cDNA is 'G' in the human genome. The
chimpanzee genome agrees with the human genomic sequence
and not the cDNA."
misc_difference 67
/gene="EGFR"
/note="'C' in cDNA is 'A' in the human genome."
CDS 258..3533
/gene="EGFR"
/codon_start=1
/product="EGFR protein"
/protein_id="AAH94761.1"
/db_xref="GI:63101670"
/db_xref="GeneID:1956"
/db_xref="MIM:131550"
/translation="MRPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKKCQGTSNKLTQLGTF
EDHFLSLQRMFNNCELGNLEITYQRNYDLSFLKTIQEAGYLIALNTERIPLE
NLQIIRGNMYYENSYALALSNYDANKTGLKELPMRNLQGQKCDPSCPNGSCWGAGEE
NCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLCRKFRDEATCKDT
CPPLMLYNPTTYQMDNPEGKYSFGATCKKCPRNYTDHGSCRACGADSYEMEED
GRKCKKCEGPCRKCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPAFRGD
SFTHTPPLDPQELDILKTKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFS
LASLNITSLGLRSLKEISDGDIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRG
ENSCKATGQCHALCSPEGCWGPEPRDCSCRNSRGRECDKCNLLEGEPREFENS
ECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCKTCPAGMGENNTLWKYA
DAGHCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMGALLLLLALGIGLFMR
RRHIRKRTLRRLLQERELEPLTPSGEAPNQALLRILKETEFKKIKLGSGAFGTY
KGLWIPEGEKKIPAIKELREATSPKANKEILDEAYMASDNPHCRLLGICLTST
QLITQLMPFGCLLDYREHKDNIGSQYLLNWCQIAKGMNYLEDRRLHRDLAARN
LKTPQHKITDFGLAKLLGAEEKEYHAEGGKPIKWMALESILHRIYTHQSDWSYG
TWELMTFGSKPYDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDYMIMKCWMIDADSRP
KFRELIIEFSKMARDPQRYLIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEEDMDDDADEYL
IPQQGFFSSPSTSRTPLLSSLSATSNNSTACIDRNGLQSCPIKEDSFLQRYSSDPTG
ALTEDSIDDTFLPPGEWLWKQSCSSTSSTHSAAASLQCPSQLPPASPEGETADL
QTQ"
misc_difference 683
/gene="EGFR"
/note="'A' in cDNA is 'C' in the human genome; no amino
acid change. The chimpanzee genome agrees with the human
genomic sequence and not the cDNA."
misc_difference 2831
/gene="EGFR"
/note="'C' in cDNA is 'T' in the human genome; no amino
acid change."
misc_difference 3674
/gene="EGFR"
/note="'A' in cDNA is 'G' in the human genome. The
chimpanzee genome agrees with the human genomic sequence
and not the cDNA."
misc_difference 3845..3859
/gene="EGFR"
/note="polyA tail: 15 bases do not align to the human
genome."
ORIGIN
1 gtccgggcag cccccggcgc agcgcggccg cagcagcctc ctccccccgc acggtgtgag
61 cgcccgccgc ggccgaggcg gccggagtcc cgagctagcc ccggcggccg ccgccgccca
121 gaccggacga caggccacct cgtcggcgtc cgcccgagtc cccgcctcgc cgccaacgcc
181 acaaccaccg cgcacggccc cctgactccg tccagtattg atcgggagag ccggagcgag
241 ctcttcgggg agcagcgatg cgaccctccg ggacggccgg ggcagcgctc ctggcgctgc
301 tggctgcgct ctgcccggcg agtcgggctc tggaggaaaa gaaagtttgc caaggcacga
361 gtaacaagct cacgcagttg ggcacttttg aagatcattt tctcagcctc cagaggatgt
421 tcaataactg tgaggtggtc cttgggaatt tggaaattac ctatgtgcag aggaattatg
481 atctttcctt cttaaagacc atccaggagg tggctggtta tgtcctcatt gccctcaaca
541 cagtggagcg aattcctttg gaaaacctgc agatcatcag aggaaatatg tactacgaaa
601 attcctatgc cttagcagtc ttatctaact atgatgcaaa taaaaccgga ctgaaggagc
661 tgcccatgag aaatttacag ggacaaaagt gtgatccaag ctgtcccaat gggagctgct
721 ggggtgcagg agaggagaac tgccagaaac tgaccaaaat catctgtgcc cagcagtgct
781 ccgggcgctg ccgtggcaag tcccccagtg actgctgcca caaccagtgt gctgcaggct
841 gcacaggccc ccgggagagc gactgcctgg tctgccgcaa attccgagac gaagccacgt
901 gcaaggacac ctgcccccca ctcatgctct acaaccccac cacgtaccag atggatgtga
961 accccgaggg caaatacagc tttggtgcca cctgcgtgaa gaagtgtccc cgtaattatg
1021 tggtgacaga tcacggctcg tgcgtccgag cctgtggggc cgacagctat gagatggagg
1081 aagacggcgt ccgcaagtgt aagaagtgcg aagggccttg ccgcaaagtg tgtaacggaa
1141 taggtattgg tgaatttaaa gactcactct ccataaatgc tacgaatatt aaacacttca
1201 aaaactgcac ctccatcagt ggcgatctcc acatcctgcc ggtggcattt aggggtgact
1261 ccttcacaca tactcctcct ctggatccac aggaactgga tattctgaaa accgtaaagg
1321 aaatcacagg gtttttgctg attcaggctt ggcctgaaaa caggacggac ctccatgcct
1381 ttgagaacct agaaatcata cgcggcagga ccaagcaaca tggtcagttt tctcttgcag
1441 tcgtcagcct gaacataaca tccttgggat tacgctccct caaggagata agtgatggag
1501 atgtgataat ttcaggaaac aaaaatttgt gctatgcaaa tacaataaac tggaaaaaac
1561 tgtttgggac ctccggtcag aaaaccaaaa ttataagcaa cagaggtgaa aacagctgca
1621 aggccacagg ccaggtctgc catgccttgt gctcccccga gggctgctgg ggcccggagc
1681 ccagggactg cgtctcttgc cggaatgtca gccgaggcag ggaatgcgtg gacaagtgca
1741 accttctgga gggtgagcca agggagtttg tggagaactc tgagtgcata cagtgccacc
1801 cagagtgcct gcctcaggcc atgaacatca cctgcacagg acggggacca gacaactgta
1861 tccagtgtgc ccactacatt gacggccccc actgcgtcaa gacctgcccg gcaggagtca
1921 tgggagaaaa caacaccctg gtctggaagt acgcagacgc cggccatgtg tgccacctgt
1981 gccatccaaa ctgcacctac ggatgcactg ggccaggtct tgaaggctgt ccaacgaatg
2041 ggcctaagat cccgtccatc gccactggga tggtgggggc cctcctcttg ctgctggtgg
2101 tggccctggg gatcggcctc ttcatgcgaa ggcgccacat cgttcggaag cgcacgctgc
2161 ggaggctgct gcaggagagg gagcttgtgg agcctcttac acccagtgga gaagctccca
2221 accaagctct cttgaggatc ttgaaggaaa ctgaattcaa aaagatcaaa gtgctgggct
2281 ccggtgcgtt cggcacggtg tataagggac tctggatccc agaaggtgag aaagttaaaa
2341 ttcccgtcgc tatcaaggaa ttaagagaag caacatctcc gaaagccaac aaggaaatcc
2401 tcgatgaagc ctacgtgatg gccagcgtgg acaaccccca cgtgtgccgc ctgctgggca
2461 tctgcctcac ctccaccgtg cagctcatca cgcagctcat gcccttcggc tgcctcctgg
2521 actatgtccg ggaacacaaa gacaatattg gctcccagta cctgctcaac tggtgtgtgc
2581 agatcgcaaa gggcatgaac tacttggagg accgtcgctt ggtgcaccgc gacctggcag
2641 ccaggaacgt actggtgaaa acaccgcagc atgtcaagat cacagatttt gggctggcca
2701 aactgctggg tgcggaagag aaagaatacc atgcagaagg aggcaaagtg cctatcaagt
2761 ggatggcatt ggaatcaatt ttacacagaa tctataccca ccagagtgat gtctggagct
2821 acggggtgac cgtttgggag ttgatgacct ttggatccaa gccatatgac ggaatccctg
2881 ccagcgagat ctcctccatc ctggagaaag gagaacgcct ccctcagcca cccatatgta
2941 ccatcgatgt ctacatgatc atggtcaagt gctggatgat agacgcagat agtcgcccaa
3001 agttccgtga gttgatcatc gaattctcca aaatggcccg agacccccag cgctaccttg
3061 tcattcaggg ggatgaaaga atgcatttgc caagtcctac agactccaac ttctaccgtg
3121 ccctgatgga tgaagaagac atggacgacg tggtggatgc cgacgagtac ctcatcccac
3181 agcagggctt cttcagcagc ccctccacgt cacggactcc cctcctgagc tctctgagtg
3241 caaccagcaa caattccacc gtggcttgca ttgatagaaa tgggctgcaa agctgtccca
3301 tcaaggaaga cagcttcttg cagcgataca gctcagaccc cacaggcgcc ttgactgagg
3361 acagcataga cgacaccttc ctcccagtgc ctggtgagtg gcttgtctgg aaacagtcct
3421 gctcctcaac ctcctcgacc cactcagcag cagccagtct ccagtgtcca agccaggtgc
3481 tccctccagc atctccagag ggggaaacag tggcagattt gcagacacag tgaagggcgt
3541 aaggagcaga taaacacatg accgagcctg cacaagctct ttgttgtgtc tggttgtttg
3601 ctgtacctct gttgtaagaa tgaatctgca aaatttctag cttatgaagc aaatcacgga
3661 catacacatc tgtatgtgtg agtgttcatg atgtgtgtac atctgtgtat gtgtgtgtgt
3721 gtatgtgtgt gtttgtgaca gatttgatcc ctgttctctc tgctggctct atcttgacct
3781 gtgaaacgta tatttaacta attaaatatt agttaatatt aataaatttt aagctttatc
3841 cagaaaaaaa aaaaaaaaa
双酶切
质粒 20ul
BamH1 4ul
Xho I 4ul
Buffer K 5ul
H2O 17ul
总共 50ul 37度过夜。
1.把ul质粒放入1.5ml冰冷的离心管中，置入冰上。
2.解冻一份感受态细胞，取50ul加入离心管中，小心混匀，置于冰上30min。
3.42度，90秒水浴，然后置于冰上2－4min。
4.加200ul无抗生素LB，37度, 60－90min，振动
5.将80ul菌液涂布于含抗生素的平板上，37度，过夜。
在六个平板上挑菌落
1.2 多个
3.4数个
5.阳性对照 无数个
6.阴性对照 无
加氨苄青霉素50ug至LB液中，注意无菌操作，挑合适的菌落至LB液中。250转，37度要摇晃过夜。
iseeyou: 请问你的RNA是合成的吗？价格如何？
rmal growth factor receptor (CL-387,785).part1.rar (292.97k)
2部分的
rmal growth factor receptor (CL-387,785).part2.rar (292.97k)
3部分的
rmal growth factor receptor (CL-387,785).part3.rar (74.55k)
只能这样了，你的油箱老退信！
空载体pscilencer 2.0 U6的OD值，酶切50ul反应体系需要DNA值小于2ug。
（质粒5）×20：260＝0.066， 0.066×1＝0.066------------- 66ug/ml
（质粒5）×50：260＝0.037， 0.037×2.5＝0.093------------ 93ug/ml
BamHI， Hind3双酶切：
NEB公司
http://www.neb.com/nebecomm/default.asp
http://www.neb.com/nebecomm/DoubleDigestCalculator.asp
Double Digest Finder
Double Digest Recommendation for BamHI + HindIII:
Double digest is not recommended. A sequential digest is required, using each enzyme in its supplied NEBuffer.
50ul反应体系：
1. 双酶切
BamHI-----------1ul
Hind 3----------1ul
NEB buffer 2------ 5ul
pscilencer2.0 U6-------15ul
BAS-----------0.5ul
H2O-------- 27.5ul
2. 序贯切
BamHI---------1ul
NEB buffer BamHI------- 5ul
pscilencer2.0 U6---------15ul
BAS----------0.5ul
H2O----------28.5ul
screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=537 height=384 title="Click to iew full 未命名.JPG (537 X 384)" border=0 align=absmiddle>
退火
A. Cloning Hairpin siRNA Inserts into pSilencer
1. Prepare a 1 µg/µl solution
of each oligonucleotide
a. Dissole the hairpin siRNA template oligonucleotides in
approximately 100 µl of nuclease-free water.
b. Dilute 1 µl of each oligonucleotide 1:100 to 1:1000 in TE (10 mM
Tris, 1 mM EDTA) and determine the absorbance at 260 nm.
Calculate the concentration (in µg/ml) of the hairpin siRNA
oligonucleotides by multiplying the A260 by the dilution factor and
then by the extinction coefficient (~33 µg/ml).
c. Dilute the oligonucleotides to approximately 1 µg/µl.
2. Anneal the siRNA
template
oligonucleotides
a. Assemble the 50 µl annealing mixture as follows:
b. Heat the mixture to 90°C for 3 min, then place in a 37°C incubator,
and incubate for 1 hr.
c. The annealed siRNA template insert can either be ligated into a
pSilencer ector or stored at –20°C for future ligation.
质粒酶切后跑电泳：
Qiagen回收：得约50ul
ShRNA1+2;shRNA3+4分别和可能双酶切和序贯切的质粒连接：16度，3小时
20ul体系（质粒：DNA＝1：1－10）
质粒 1ul
DNA 5ul
T4连接酶 1ul
Buffer 2ul
H2O 11ul
ShRNA1+2 × 质粒1（双酶切） ＝6 重组质粒
shRNA3+4 ......... 质粒2（序贯酶切）
............................质粒3（不确定酶切）
转化感受态大肠杆菌
1.把10ul质粒放入1.5ml冰冷的离心管中，置入冰上。
2.解冻一份感受态细胞，取100ul加入离心管中，小心混匀，置于冰上30min。
3.42度，90秒水浴，然后置于冰上2－4min。
4.加500ul无抗生素LB，37度, 60－90min，振动。（消毒玻璃棒，紫外光消毒）
5.将200ul菌液涂布于含抗生素的平板上，5min后反转。37度，过夜。
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archie/post/758491_0.html
连接后转化，克隆失败分析原因。
重新开了1OD生工的到oligo。离心后开盖。配成1ug/ul.
按照ambion的指引退火。
体系：
50＝2＋2＋46
条件： Heat the mixture to 90°C for 3 min, then place in a 37°C incubator,
and incubate for 1 hr.
稀释10倍：
Dilute 5 µl of the annealed siRNA template insert with 45 µl
nuclease-free water for a final concentration of 8 ng/µl.
连接：16度2小时。
体系：10＝1DNA+1T4连接酶＋1buffer＋1ector＋6H2O
质粒用takara公司的BamHI 和Hind 3双酶切的psilencer 2.0 U6。
转化：设立阳性对照。
1.把10ul质粒放入1.5ml冰冷的离心管中，置入冰上。
2.解冻一份感受态细胞，取100ul加入离心管中，小心混匀，置于冰上30min。
3.42度，90秒水浴，然后置于冰上4min。
4.加500ul无抗生素LB，37度, 60－90min，振动。
5.将400ul菌液涂布于含抗生素的平板上，5min后反转。37度，过夜。
阳性对照布满菌落，但是其他平板无菌落生长。还是没有连接上。
非变性胶page电泳15%
分8管跑，shRNA1-4 单链。95度10min然后自然冷却和90度5min，37度1hr两种条件退火。
1. 公司shRNA 4 oligo合成有误。
2. 95度10min然后PCR仪内自然冷却是更好的退火条件。
pSilencer 2_0-U6 ector Map and Related Information
http://www.ambion.com/techlib/misc/ectors/2.0_U6.html#restriction
用2.0 reerse 引物测了约前300bp
ACAGGGGGATTCAGTCCGACGTTGTAAACGACGGCAGTGCCAGCTAGCGGCCGCATACAAAAAACCAACACACAGATCCATGAAATAAAAGATCCTTTATTAAGCTTAACTCTGGAGGAAAAGAAAGTTCTCTTGAAACTTTCTTTTCCTCCAGAGCGGATCCACGGTTCACTAAACCAGCTCTGCTTATATAGACCTCCCACCGTACACGCCTACCGCCCATTTGCGTCAATGGGGCGGAGTTGTTACGACATTTTGGAAAGTCCCGTTGATTTTGGTGCCAAAACAAACTCCCATTGACGTCATGGGGTGGAGACTTGGAATCCCGTGAGTCAACCGCTATCCACGCCCTTGATGTACTGCCAAACCGCATCACCATGGTAATAGCATGACAATACGTAAATGACTGCCAGTAGGAAAGCCCATAAGGCATGACTGGGCTAATGCCGATATAACCTGATGATGGCAAGGGGCGTTTACGAAAACCCCCCTTGAGCCATGGAAGCCCATTGGGGTTTATGGAAAAACTTTTTTGTCTATGGCGGGGGCTTGGGGCCCCCGGGCCTTTCGATTTTACGGAACCTATGGGGTGAATAGCCGGATATATATAAAAAAAAACGGGCGTGTCTCTCTCTCTTTAGAGATCTCTCTCCAAGAGGAATATCTCTCTCTGGGCACACGATATCACTAAACTTTTGGGAGATTCCCAACCACCCAAACAGAAGAAGACGGGGAGAGATATATTTTGCTCTCTCTCTCAGACCGCGGTATAGCGGGA
基本表明shRNA1+2-psilencer 2.0 U6载体构建成功。
RAS Is Regulated by the let-7 MicroRNA Family
RAS受到let-7小RNA家族的调节
S.M. Johnson, H. Grosshans, J. Shingara, M. Byrom, R. Jaris, A. Cheng, E.
Labourier, K.L. Reinert, D. Brown, and F.J. Slack
http://www.cell.com/cgi/content/abstract/120/5/635
最近的一些研究工作把一些小RNA与癌症联系在一起。例如，let-7小RNA水平降低与肺癌相关，但是它们是否真的在癌变中发挥作用还不得而知。本文中Johnson等人显示microRNA let-7家族通过RAS 3’非翻译区的序列抑制RAS癌基因的表达。这些发现与在肺癌细胞中RAS水平上升一致。该研究提示let-7 miRNA表达的降低有助于肿瘤形成，为将来的癌症治疗提供了新的靶向RAS的microRNA的可能。
中国生物技术信息网：耶鲁大学的一项新研究确定出了肺癌中一种基因受调节的新方式。这项研究为肺癌的诊断和治疗提供了新的可能。研究的相关文章发表在3月的Cell and Deelopmental Cell杂志上。
癌基因Ras在大约20％的癌症中因突变而发生了过表达或活化。耶鲁大学癌症中心的Slack领导的研究组已经确定出一个与肺癌有关的染色体区域上的一种天然且独立转录的 RNA——let-7是Ras表达的一种调节因子。
植物和动物的DNA都含有编码microRNA的序列，这种RNA是发育的重要调节因子。Let-7 mrioRNA通过与Ras信息结合来调节Ras并可能抑制Ras蛋白的翻译。MicroRNA不能将突变的Ras变回正常，但它能充当一个被“加速”的Ras的“刹车”。
目前，肺癌的预后很差，患者五年存活率不到15％。而基于let-7的基因治疗可能成为缓解这种癌症的一种可行的方法。
先前，Slack发现线虫需要let-7 RNA进行正常的发育——没有这种物质，细胞就不能停止分裂并且无法分化成正常的蠕虫结构。在知道let-7是一种细胞分裂调节因子后，Slack的研究组通过生物信息学方法发现了它与let-7的关系。人类的let-7与线虫的相对序列相同，并且与Ras结合的位点和通路也高度保守。与正常的毗邻组织相比，肺癌组织的let-7减少了，而Ras则增加了。
这项研究发现了有关一种与癌症密切相关的基因的调节的新方面。接下来，这个研究组的研究人员还将继续对肿瘤发展的原因进行进一步研究。 ( 生物谷 )
学习中
中提质粒的OD值：稀释50倍
------------------------ OD260---------260/280---------OD*2.5(单位ug/ul)------*约200ul
GAPDH----------------- 0.367-----------1.863------------0.9157------------------183ug
阴性对照------------- 0.112-----------1.806------------0.28---------------------56ug
56shRNA1+2-----------0.022-----------1.571------------0.055---------------------11ug
64 5+6----------------- 0.343-----------1.815------------0.8575-----------------171.5ug
浓度(单位ug/ul)计算为OD值的倍数:
稀释20倍*1
稀释50倍*2.5
稀释100倍*5
纯度标准 DNA 1.8,RNA 2.0
如低考虑蛋白质污染,高考虑RNA污染.
1.56shRNA1+2-----------0.022-----------1.571------------0.055--------------11ug
准备重新摇菌，中提质粒
2.养A549细胞
3.
67bp 1+2
1. 5’-GATCCAACTCTGGAGGAAAAGAAAGTTTCAAGAGAACTTTCTTTTCCTCCAGAGTTTTTTTTGGAAA-3’
2.5’-AGCTTTTCCAAAAAAAACTCTGGAGGAAAAGAAAGTTCTCTTGAAACTTTCTTTTCCTCCAGAGTTG-3’
编号B1,B2准备中提
4.阴性对照准备中提。
5.确定psilencer 2.0 U6质粒序列
复苏肺癌A549细胞株，24小时后换液仍未见贴壁。
查HER2和EGF干扰序列。
配液：细胞营养液＋10％胎牛血清＋青链双抗。
中提质粒56shRNA1+2和67 1+2,可能失败。
6－well铺板明天准备转染。
中提质粒的OD值：稀释20倍
------------------------ OD260---------260/280---------OD*1(单位ug/ul)------*约200ul
56shRNA1+2-----------0.17-----------1.6------------0.098---------------------------34ug
67 1+2--------------- 0.079-----------2.0---------------0.166---------------------15.8ug
细胞换夜/传代/铺6孔板，准备转染。
转染
A=250ml无血清培养基＋lipofectamine 10ul 混合5min
B=250ml无血清培养基（使用前37℃预热）＋DNA 4ug
在配好上液30min内
A+B=500ul混合20min。
6－well换无血清无抗生素培养液1500ul。
A+B加入well中混匀，通过轻轻地前后摇动培养板混合。
6小时后换液成有血清培养基。
在CO2培养箱中37度温育18－48小时。进行转染后的其它检测步骤。
影响基因阻断水平（Gene Knockdown Leel）的因素：
在RNAi实验中，有许多因素影响目的基因表达的降低程度（例如:基因阻断），包括：
• 转染效率
• 目的基因转录效率
• 蛋白稳定性
• 选择特殊Stealth™RNA或者siRNA序列的效率
• 选择哺乳动物细胞系的生长特征
转染的一般性指导
使用Lipofectamine™2000转染Stealth™RNA或者siRNA进入哺乳动物细胞时，遵从以下一般性指导：
1 为了获得最佳基因阻断结果，每一种细胞系转染Stealth™RNA或者siRNA的量都需要经过实验确定。如果您是首次转染您的细胞系，推荐尝试使用几个Lipofectamine™2000的浓度，并在20-100nM范围内改变Stealth™RNA或者siRNA的浓度，以确定达到最佳基因阻断水平所需要的条件。高浓度的Stealth™RNA或者siRNA可能具有细胞系依赖性。注：我们推荐开始时使用40nM Stealth™RNA或者siRNA。
2 在30-50％细胞汇合度时进行转染。通常基因阻断的分析至少要在转染后24-72小时进行。低密度转染细胞允许转染和分析之间更长的间隙以及最小化由于细胞过度生长造成的细胞活性的损害。根据靶基因的特性，高密度转染的细胞可能更加适合条件的优化。
3 不要在转染时的培养基中加入抗生素，因为这将会降低细胞转染的效率和导致细胞死亡。
4 为了获得更好的结果，可以使用Opti-MEM® I 低血清培养基（目录号31958-062）在形成复合物前稀释Lipofectamine™2000和Stealth™RNA或者siRNA寡聚物。
5 可以使用initrogen BLOCK-iT™荧光寡聚物(BLOCK-iT™ Fluorescent Oligo)(目录号 2013)帮助优化细胞系的转染条件。一旦确定了用来转染的最佳条件，在每一次实验都包括BLOCK-iT™荧光寡聚物，作为转染效率的指示剂。如果需要的更多的信息，请参阅BLOCK-iT™荧光寡聚物说明书，说明书可以通过我们的网站下载或者通过拨打技术服务热线。
需要材料
开始实验前准备下列试剂：
• 目的哺乳动物细胞系（使用传代数低的细胞；转染前确信细胞健康和超过90％的活率）
• 目的Stealth™RNA或者siRNA寡聚物（20μM溶解在退火缓冲液中）
• Lipofectamine™2000试剂（使用前贮存在+4℃）
• Opti-MEM® I 低血清培养基（使用前37℃预热）
• 合适的组织培养板及其它转染步骤
使用Lipofectamine™2000转染Stealth™RNA或者siRNA进入哺乳动物细胞时，使用下述步骤。参阅下列表格《推荐试剂的量和体积》以确定加入不同组织培养方式的试剂量以及体积。使用推荐Lipofectamine™2000的量作为起始点，针对您的细胞系和Stealth™RNA或者siRNA进行条件优化。
1 转染前一天，在不包含抗生素的适量的培养基中接种细胞，转染时细胞的汇合度要达到30-50％。
2 每一个转染样品都要按照如下的方法准备寡聚物- Lipofectamine™2000复合物：
a. 在适量的不包含血清的Opti-MEM® I 低血清培养基稀释Stealth™RNA或者siRNA寡聚物。轻轻混匀。
b. 使用前轻轻混合Lipofectamine™2000，然后稀释适量的试剂到Opti-MEM® I 低血清培养基。轻轻混匀后在室温下孵育5分钟。
注：在30分钟内混合稀释的Lipofectamine™2000和稀释的寡聚物。更长的孵育时间可能会降低活性。
c. 孵育5分钟后，混合稀释的寡聚物和稀释的Lipofectamine™2000。轻轻混合，在室温下孵育20分钟，以允许复合物的形成。溶液可能出现混浊，但是这不会影响转染。
3 将寡聚物- Lipofectamine™2000复合物加入到每一个包含细胞和培养基的孔中。通过轻轻地前后摇动培养板混合。
4 37℃，CO2培养箱孵育24-96小时，直到适合准备好进行基因阻断分析。不需要去除复合物或者改换培养基；然而，在转染后4-6小时改换培养基也不会损失转染的活性。
转染质粒所需要的量:4ug
ul数:
GAPDH :4/0.9175=4.36ul*3管
阴性对照:4/0.28=14.3ul*3管
64 5+6:4/0.8575=4.66ul*3管
加了一管没有转染的作为对照.
拍照顺序:
+ + -
- - +
64 64 64
无转染对照
转染时细胞融合度? 30-50% or 90%
转染6小时后是否需要换成有血清培养基?
韩 her2
5’-GATCCgatctttgggagcctggcaTTCAAGAGAtgccaggctcccaaagatcTTTTTTGGAAA -3’
3’-3GctagaaaccctcggaccgtAAGTTCTCTacggtccgagggtttctagAAAAAACCTTTTCGA-5’[color=red][/color]出处
Neoplasia . ol. 6, No. 6, Noember/December 2004, pp. 786 – 795
Silencing of the HER2/neu Gene by siRNA Inhibits Proliferation and Induces Apoptosis in HER2/neu–Oerexpressing
Breast Cancer Cells1 Timo Faltus, Juping Yuan, Brigitte Zimmer, Andrea Kra¨mer, Sibylle Loibl, Manfred Kaufmann and Klaus Strebhardt
Department of Obstetrics and Gynecology, Medical School, J. W. Goethe Uniersity, Theodor-Stern-Kai 7,
Frankfurt 60590, Germany
今天退火，跑电泳，连接，转化，铺板。
我做的是siRNA，针对病毒复制的。
转染结果还是可以的，至于结果没有达到预期，只能重复实验看看！
从荧光上看，转的还可以
阴性对照细胞，什么都没转
（缩略图，点击图片链接看原图）
Ø DAPI，即2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride，也称DAPI dihydrochloride，分子式为C16H15N5·2HCl，分子量为350.25，CAS Number 28718-90-3。
Ø DAPI是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料。和双链DNA结合后可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光。和EB(ethidium bromide)相比，对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。
Ø DAPI染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。
Ø DAPI的最大激发波长为340nm，最大发射波长为488nm；DAPI和双链DNA结合后最大激发波长为364nm，最大发射波长为454nm。
Ø 本DAPI溶液用水配制。
Ø 用于细胞核染色时，推荐的DAPI工作浓度为0.5-10微克/毫升。
注意事项：
Ø DAPI对人体有一定刺激性，请注意适当防护。
Ø 荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽量当天完成检测。
Ø 为减缓荧光淬灭可以使用抗荧光淬灭封片液。抗荧光淬灭封片液可以向碧云天订购。
Ø 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
加甲醛的注意不能用酒精灯烧瓶口。
HER 2干扰序列小提质粒，测OD值，跑电泳（1.2.3.4）明日测序
引物：2.0 reerse primer
DAPI 96孔板第二排，酒精灯烧瓶口差点至火，pscilencer 2.0 U6 空载体细胞死亡最多（不知道什么原因），转染高峰大概在30－48小时之间。
1.测序：
中提：阴性对照，64 5+6，56 12，67 12
小提：56 12，67 12，HER 2-1，HER 2-2
2.DAPI 96孔板 第三排，发现阴性对照调亡最严重，其次是 64 5+6
3.LYD细胞传代，准备测 EGFR，HER2，EGF表达
4.72小时GAPDH转染荧光染料显色下降
5.早上10am-9pm小摇；9pm-中摇。准备明日中提：
Pscilencer 2.0 U6 空载体，67 1+2，56 sh 1+2（此两干扰序列一样）
----------------------------------
67bp 1+2
1. 5’-GATCCAACTCTGGAGGAAAAGAAAGTTTCAAGAGAACTTTCTTTTCCTCCAGAGTTTTTTTTGGAAA-3’
2.5’-AGCTTTTCCAAAAAAAACTCTGGAGGAAAAGAAAGTTCTCTTGAAACTTTCTTTTCCTCCAGAGTTG-3’
56bp shRNA1+2
ShRNA1：5ˊ-GATCCGCTCTGGAGGAAAAGAAAGTTTCAAGAGAACTTTCTTTTCCTCCAGAGTTA - 3ˊ
ShRNA2：5ˊ-AGCTTAACTCTGGAGGAAAAGAAAGTTCTCTTGAAACTTTCTTTTCCTCCAGAGCG -3ˊ
--------------------------------------
GAPDH : 8/0.9175=8.719ul
阴性对照: 8/0.28=28.57ul
64 5+6: 8/0.8575=9.33ul
56 1+2： 8/0.17=47 ul
67 1+2: 8/0.079=100ul
cell
+500ul
lipofectamine 20ul+500ul
cell line 60-70%
ol of plating medium:5000ul
pEGFP-C1
Restriction Map and Multiple Cloning Site of pEGFP-C1. (Unique restriction sites are in bold.) The Xba I and Bcl I sites are methylated in the DNA proided by CLONTECH. If you wish to digest the ector with these enzymes, you will need to transform the ector into a dam- host and make fresh DNA.
Note: The ector sequence file has been compiled from information in the sequence database, published literature, and other sources, together with partial sequences obtained by CLONTECH. This ector has not been completely sequenced.
Description
pEGFP-C1 encodes a red-shifted ariant of wild-type GFP (1–3) which has been optimized for brighter fluorescence and higher expression in mammalian cells. (Excitation maximum = 488 nm; emission maximum = 507 nm.) pEGFP-C1 encodes the GFPmut1 ariant (4) which contains the double-amino-acid substitution of Phe-64 to Leu and Ser-65 to Thr. The coding sequence of the EGFP gene contains more than 190 silent base changes which correspond to human codon-usage preferences (5). Sequences flanking EGFP hae been conerted to a Kozak consensus translation initiation site to further increase the translation efficiency in eukaryotic cells. The MCS in pEGFP-C1 is between the EGFP coding sequences and the S40 poly A. Genes cloned into the MCS will be expressed as fusions to the C-terminus of EGFP if they are in the same reading frame as EGFP and there are no interening stop codons. S40 polyadenylation signals downstream of the EGFP gene direct proper processing of the 3' end of the EGFP mRNA. The ector backbone also contains an S40 origin for replication in mammalian cells expressing the S40 T-antigen. A neomycin resistance cassette (neor), consisting of the S40 early promoter, the neomycin/kanamycin resistance gene of Tn5, and polyadenylation signals from the Herpes simplex thymidine kinase (HS TK) gene, allows stably transfected eukaryotic cells to be selected using G418. A bacterial promoter upstream of this cassette expresses kanamycin resistance in E. coli. The pEGFP-C1 backbone also proides a pUC origin of replication for propagation in E. coli and an f1 origin for single-stranded DNA production.
Use
Fusions to the C-terminus of EGFP retain the fluorescent properties of the natie protein allowing the localization of the fusion protein in io. The target gene should be cloned into pEGFP-C1 so that it is in frame with the EGFP coding sequences, with no interening in-frame stop codons. The recombinant EGFP ector can be transfected into mammalian cells using any standard transfection method. If required, stable transformants can be selected using G418 (7). pEGFP-C1 can also be used simply to express EGFP in a cell line of interest (e.g., as a transfection marker).
Location of Features
• Human cytomegaloirus (CM) immediate early promoter: 1–589
Enhancer region: 59–465
TATA box: 554–560
Transcription start point: 583
CG mutation to remoe Sac I site: 569
• Enhanced green fluorescent protein gene
Kozak consensus translation initiation site: 606–616
Start codon (ATG): 613–615; Stop codon: 1408–1410
Insertion of al at position 2: 616–618
GFPmut1 chromophore mutations (Phe-64 to Leu; Ser-65 to Thr): 805–810
His-231 to Leu mutation (AT): 1307
Last amino acid in wild-type GFP: 1327–1329
• MCS: 1330–1417
• S40 early mRNA polyadenylation signal
Polyadenylation signals: 1550–1555 & 1579–1584
mRNA 3' ends: 1588 & 1600
• f1 single-strand DNA origin: 1647–2102 (Packages the noncoding strand of EGFP.)
• Bacterial promoter for expression of Kanr gene
–35 region: 2164–2169; –10 region: 2187–2192
Transcription start point: 2199
• S40 origin of replication: 2443–2578
• S40 early promoter
Enhancer (72-bp tandem repeats): 2276–2347 & 2348–2419
21-bp repeats: 2423–2443, 2444–2464, & 2466–2486
Early promoter element: 2499–2505
Major transcription start points: 2495, 2533, 2539 & 2544
• Kanamycin/neomycin resistance gene
Neomycin phosphotransferase coding sequences:
Start codon (ATG): 2627–2629; stop codon: 3419–3421
GA mutation to remoe Pst I site: 2809
CA (Arg to Ser) mutation to remoe BssH II site: 3155
• Herpes simplex irus (HS) thymidine kinase (TK) polyadenylation signal
Polyadenylation signals: 3657–3662 & 3670–3675
• pUC plasmid replication origin: 4006–4649
Primer Locations
• EGFP-N Sequencing Primer (#6479-1): 679–658
• EGFP-C Sequencing Primer (#6478-1): 1266–1287
序列：
TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC ATTAGTTCAT AGCCCATATA TGGAGTTCCG
CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCTGACCG CCCAACGACC CCCGCCCATT
GACGTCAATA ATGACGTATG TTCCCATAGT AACGCCAATA GGGACTTTCC ATTGACGTCA
ATGGGTGGAG TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT ATCATATGCC
AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC GCCTGGCATT ATGCCCAGTA
CATGACCTTA TGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC GTATTAGTCA TCGCTATTAC
CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA TGGGCGTGGA TAGCGGTTTG ACTCACGGGG
ATTTCCAAGT CTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTG TTTTGGCACC AAAATCAACG
GGACTTTCCA AAATGTCGTA ACAACTCCGC CCCATTGACG CAAATGGGCG GTAGGCGTGT
ACGGTGGGAG GTCTATATAA GCAGAGCTGG TTTAGTGAAC CGTCAGATCC GCTAGCGCTA
CCGGTCGCCA CCATGGTGAG CAAGGGCGAG GAGCTGTTCA CCGGGGTGGT GCCCATCCTG
GTCGAGCTGG ACGGCGACGT AAACGGCCAC AAGTTCAGCG TGTCCGGCGA GGGCGAGGGC
GATGCCACCT ACGGCAAGCT GACCCTGAAG TTCATCTGCA CCACCGGCAA GCTGCCCGTG
CCCTGGCCCA CCCTCGTGAC CACCCTGACC TACGGCGTGC AGTGCTTCAG CCGCTACCCC
GACCACATGA AGCAGCACGA CTTCTTCAAG TCCGCCATGC CCGAAGGCTA CGTCCAGGAG
CGCACCATCT TCTTCAAGGA CGACGGCAAC TACAAGACCC GCGCCGAGGT GAAGTTCGAG
GGCGACACCC TGGTGAACCG CATCGAGCTG AAGGGCATCG ACTTCAAGGA GGACGGCAAC
ATCCTGGGGC ACAAGCTGGA GTACAACTAC AACAGCCACA ACGTCTATAT CATGGCCGAC
AAGCAGAAGA ACGGCATCAA GGTGAACTTC AAGATCCGCC ACAACATCGA GGACGGCAGC
GTGCAGCTCG CCGACCACTA CCAGCAGAAC ACCCCCATCG GCGACGGCCC CGTGCTGCTG
CCCGACAACC ACTACCTGAG CACCCAGTCC GCCCTGAGCA AAGACCCCAA CGAGAAGCGC
GATCACATGG TCCTGCTGGA GTTCGTGACC GCCGCCGGGA TCACTCTCGG CATGGACGAG
CTGTACAAGT CCGGACTCAG ATCTCGAGCT CAAGCTTCGA ATTCTGCAGT CGACGGTACC
GCGGGCCCGG GATCCACCGG ATCTAGATAA CTGATCATAA TCAGCCATAC CACATTTGTA
GAGGTTTTAC TTGCTTTAAA AAACCTCCCA CACCTCCCCC TGAACCTGAA ACATAAAATG
AATGCAATTG TTGTTGTTAA CTTGTTTATT GCAGCTTATA ATGGTTACAA ATAAAGCAAT
AGCATCACAA ATTTCACAAA TAAAGCATTT TTTTCACTGC ATTCTAGTTG TGGTTTGTCC
AAACTCATCA ATGTATCTTA ACGCGTAAAT TGTAAGCGTT AATATTTTGT TAAAATTCGC
GTTAAATTTT TGTTAAATCA GCTCATTTTT TAACCAATAG GCCGAAATCG GCAAAATCCC
TTATAAATCA AAAGAATAGA CCGAGATAGG GTTGAGTGTT GTTCCAGTTT GGAACAAGAG
TCCACTATTA AAGAACGTGG ACTCCAACGT CAAAGGGCGA AAAACCGTCT ATCAGGGCGA
TGGCCCACTA CGTGAACCAT CACCCTAATC AAGTTTTTTG GGGTCGAGGT GCCGTAAAGC
ACTAAATCGG AACCCTAAAG GGAGCCCCCG ATTTAGAGCT TGACGGGGAA AGCCGGCGAA
CGTGGCGAGA AAGGAAGGGA AGAAAGCGAA AGGAGCGGGC GCTAGGGCGC TGGCAAGTGT
AGCGGTCACG CTGCGCGTAA CCACCACACC CGCCGCGCTT AATGCGCCGC TACAGGGCGC
GTCAGGTGGC ACTTTTCGGG GAAATGTGCG CGGAACCCCT ATTTGTTTAT TTTTCTAAAT
ACATTCAAAT ATGTATCCGC TCATGAGACA ATAACCCTGA TAAATGCTTC AATAATATTG
AAAAAGGAAG AGTCCTGAGG CGGAAAGAAC CAGCTGTGGA ATGTGTGTCA GTTAGGGTGT
GGAAAGTCCC CAGGCTCCCC AGCAGGCAGA AGTATGCAAA GCATGCATCT CAATTAGTCA
GCAACCAGGT GTGGAAAGTC CCCAGGCTCC CCAGCAGGCA GAAGTATGCA AAGCATGCAT
CTCAATTAGT CAGCAACCAT AGTCCCGCCC CTAACTCCGC CCATCCCGCC CCTAACTCCG
CCCAGTTCCG CCCATTCTCC GCCCCATGGC TGACTAATTT TTTTTATTTA TGCAGAGGCC
GAGGCCGCCT CGGCCTCTGA GCTATTCCAG AAGTAGTGAG GAGGCTTTTT TGGAGGCCTA
GGCTTTTGCA AAGATCGATC AAGAGACAGG ATGAGGATCG TTTCGCATGA TTGAACAAGA
TGGATTGCAC GCAGGTTCTC CGGCCGCTTG GGTGGAGAGG CTATTCGGCT ATGACTGGGC
ACAACAGACA ATCGGCTGCT CTGATGCCGC CGTGTTCCGG CTGTCAGCGC AGGGGCGCCC
GGTTCTTTTT GTCAAGACCG ACCTGTCCGG TGCCCTGAAT GAACTGCAAG ACGAGGCAGC
GCGGCTATCG TGGCTGGCCA CGACGGGCGT TCCTTGCGCA GCTGTGCTCG ACGTTGTCAC
TGAAGCGGGA AGGGACTGGC TGCTATTGGG CGAAGTGCCG GGGCAGGATC TCCTGTCATC
TCACCTTGCT CCTGCCGAGA AAGTATCCAT CATGGCTGAT GCAATGCGGC GGCTGCATAC
GCTTGATCCG GCTACCTGCC CATTCGACCA CCAAGCGAAA CATCGCATCG AGCGAGCACG
TACTCGGATG GAAGCCGGTC TTGTCGATCA GGATGATCTG GACGAAGAGC ATCAGGGGCT
CGCGCCAGCC GAACTGTTCG CCAGGCTCAA GGCGAGCATG CCCGACGGCG AGGATCTCGT
CGTGACCCAT GGCGATGCCT GCTTGCCGAA TATCATGGTG GAAAATGGCC GCTTTTCTGG
ATTCATCGAC TGTGGCCGGC TGGGTGTGGC GGACCGCTAT CAGGACATAG CGTTGGCTAC
CCGTGATATT GCTGAAGAGC TTGGCGGCGA ATGGGCTGAC CGCTTCCTCG TGCTTTACGG
TATCGCCGCT CCCGATTCGC AGCGCATCGC CTTCTATCGC CTTCTTGACG AGTTCTTCTG
AGCGGGACTC TGGGGTTCGA AATGACCGAC CAAGCGACGC CCAACCTGCC ATCACGAGAT
TTCGATTCCA CCGCCGCCTT CTATGAAAGG TTGGGCTTCG GAATCGTTTT CCGGGACGCC
GGCTGGATGA TCCTCCAGCG CGGGGATCTC ATGCTGGAGT TCTTCGCCCA CCCTAGGGGG
AGGCTAACTG AAACACGGAA GGAGACAATA CCGGAAGGAA CCCGCGCTAT GACGGCAATA
AAAAGACAGA ATAAAACGCA CGGTGTTGGG TCGTTTGTTC ATAAACGCGG GGTTCGGTCC
CAGGGCTGGC ACTCTGTCGA TACCCCACCG AGACCCCATT GGGGCCAATA CGCCCGCGTT
TCTTCCTTTT CCCCACCCCA CCCCCCAAGT TCGGGTGAAG GCCCAGGGCT CGCAGCCAAC
GTCGGGGCGG CAGGCCCTGC CATAGCCTCA GGTTACTCAT ATATACTTTA GATTGATTTA
AAACTTCATT TTTAATTTAA AAGGATCTAG GTGAAGATCC TTTTTGATAA TCTCATGACC
AAAATCCCTT AACGTGAGTT TTCGTTCCAC TGAGCGTCAG ACCCCGTAGA AAAGATCAAA
GGATCTTCTT GAGATCCTTT TTTTCTGCGC GTAATCTGCT GCTTGCAAAC AAAAAAACCA
CCGCTACCAG CGGTGGTTTG TTTGCCGGAT CAAGAGCTAC CAACTCTTTT TCCGAAGGTA
ACTGGCTTCA GCAGAGCGCA GATACCAAAT ACTGTCCTTC TAGTGTAGCC GTAGTTAGGC
CACCACTTCA AGAACTCTGT AGCACCGCCT ACATACCTCG CTCTGCTAAT CCTGTTACCA
GTGGCTGCTG CCAGTGGCGA TAAGTCGTGT CTTACCGGGT TGGACTCAAG ACGATAGTTA
CCGGATAAGG CGCAGCGGTC GGGCTGAACG GGGGGTTCGT GCACACAGCC CAGCTTGGAG
CGAACGACCT ACACCGAACT GAGATACCTA CAGCGTGAGC TATGAGAAAG CGCCACGCTT
CCCGAAGGGA GAAAGGCGGA CAGGTATCCG GTAAGCGGCA GGGTCGGAAC AGGAGAGCGC
ACGAGGGAGC TTCCAGGGGG AAACGCCTGG TATCTTTATA GTCCTGTCGG GTTTCGCCAC
CTCTGACTTG AGCGTCGATT TTTGTGATGC TCGTCAGGGG GGCGGAGCCT ATGGAAAAAC
GCCAGCAACG CGGCCTTTTT ACGGTTCCTG GCCTTTTGCT GGCCTTTTGC TCACATGTTC
TTTCCTGCGT TATCCCCTGA TTCTGTGGAT AACCGTATTA CCGCCATGCA T
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pEGFP-C1
screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=637 height=82 title="Click to iew full 未命名.gif (637 X 82)" border=0 align=absmiddle>
阳性对照和干扰序列分开转还是共转染。
HER2-1测序至100+bp中断，重新摇菌测序及逆向T7引物测序：HER2-2，HER2-4。
再确定HER2第三条干扰序列。
1.中提质粒 6712，5612，阴性对照
2.流式细胞测EGFR转染率：25.1%(42小时，转染时细胞密度85%)
3.乙醇固定过夜，流式细胞测细胞周期
4.消化细胞，pbs清洗准备做western blot
转染条件优化：
1.转染时细胞密度60%
2.质粒：转染试剂比例按照说明书
3.细胞状态良好
4.无血清无抗生素培养基提前一天用（获用优化optimal 培养基），6－12小时后换有血清。
5.用10cm2瓶
6.转染效率一般40小时左右达到高峰（6－12－24－40－48－60－72）。
7.沉默效率40小时达高峰。（24－40－48－60－72）.
GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）由4个30－40kDa的亚基组成，分子量146kDa。广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。
Western Blotting检测条带大约在36kDa，
screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=392 height=90 title="Click to iew full 88684491.gif (392 X 90)" border=0 align=absmiddle>
western 配胶
分离胶加入玻璃后，用95%酒精溶液封住其表层，待分离胶凝固后直接将酒精倾去，稍晾干后（2-4min），在加入配好的积层胶。相信大多数地方都是这样做的，效果很好。
制好的胶应尽快使用，若暂时不使用，也可以放在4度放瓶子里存放几个小时，瓶子里加缓冲液（不要拔掉梳子）。
8％分离胶 10ml：
水 4.6ml
30％丙稀酰胺 2.6ml
1ML tris （PH 8.8） 2.6ml
10％SDS 0.1ml
10％ AP 0.1ml
TEMED 0.006ml
3.5%积层胶 3ml：
水 2.25ml
30％丙稀酰胺 0.35ml
1ML tris （PH 8.8） 0.38ml
10％SDS 0.03ml
10％ AP 0.03
TEMED 0.003ml
75mm和100mm
straywinddog：
siRNA针对的是mRNA，RT-PCR检测的是mRNA水平，别说24小时，甚至12小时或更短时间你都能检测到mRNA水平的变化。发生切割作用是一个短时间的过程，在体外实验，一般30分钟或更短都可以观察到mRNA的降解。而具体发挥生物学功能的是蛋白质，细胞中的蛋白质具体表现为自身半衰期和量的问题，RNAi是“knock down”，而不是“knock out” 。mRNA水平是第一步，蛋白质水平降低为第二步，生物学功能是紧接的第三步。这样的时间差异，实在很正常！
MTT:
转染后24小时，48小时，72小时，96小时(每种细胞每一时点3孔)，换上每孔180ul1640培养液，再加入２０ulＭＴＴ溶液（５mg/ml)，孵育４个小时后，吸净每孔中的液体，加入１５０ulＤＭＳＯ溶液，振荡器上振荡10min，于自动酶标仪在４９０nm和570nm波长下测定ＯＤ值。
预留空白孔只加150ul DMSO.
------------
MTT比色法是一种检测细胞存活和增殖的方法，所用的显色剂是一种能接受氢原子的化合物MTT，原理是，活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能将淡黄色的MTT还原为蓝紫色的结晶formazan，后者的产量与活细胞数成正相关。formazan可用DMSO、无水乙醇或酸化异丙醇等溶解，在酶标仪上以波长560nm进行比色。所检测的OD值的大小可反应细胞代谢活性的强弱。
优点：灵敏度高，操作简便，自动化。
缺点：影响因素多，重复性较差。文字
注意：MTT有毒性致突变性，操作时应注意防护。
实验方法
一般我们是用96孔板来做细胞MTT实验。
1.细胞铺板
2.配制5mg/ml的MTT溶液（溶于0.1M PBS）,过滤(但是我实际上发现不过滤对实验也没有影响)。
3.每孔加入20 微升MTT溶液，37度孵育4小时后，小心吸出孔内培养基，可见孔内有蓝紫色结晶物。
4.每孔加入DMSO 150微升，振摇10min，490nm处用酶标仪测量每孔吸光度。
悬浮细胞和贴壁细胞的MTT法有差别,溶解剂要有所选择,我做悬浮细胞溶解剂用的是SDS-DMF(效果较好,不用弃上清),贴壁细胞的选择范围就广一些,你可以根据自己的具体实验选择.
western blot
maker，－，＋，56，64，67，cell
56的shRNA有干扰效果。
western blot前，裂解细胞提取蛋白加loading前测蛋白浓度，调整好加样量和浓度一致。
06.1.19中提后测OD:
-----------------------260-----------------------260/280-------------------ug/ul
＋-------------------0.324----------------------1.84----------------------0.81
－-------------------0.128-----------------------1.829-------------------0.32
64-------------------0.412------------------------1.864------------------1.03
—-------------------0.281-------------------------1.822-------------------0.703
56--------------------0.408------------------------1.838--------------------1.02
67---------------------0.485-----------------------1.783--------------------1.23
Prepare complexes using a DNA (μg) to Lipofectamine™ 2000 (μl) ratio of 1:2 to 1:3 for most cell lines.
1. 准备无血清无抗生素培养基7×20
2. 7×2＝14个1.5mlEP管，每个加培养基250ml。
3.加质粒
＋ ul数＝4/0.81=4.93
－ ul数＝4/0.32=12.5
64 ul数＝4/1.03=3.88
— ul数＝4/0.703=5.68
56 ul数＝4/1.02=3.9
67 ul数＝4/1.23=3.25
4. 加lipofectamine 2000 各10ul
5.等10min
6.混合质粒和lipofectamine 20－25min
7.细胞换液各1500ul。（转染时细胞融合度约80％）
8.500ul质粒转染试剂混合物加入培养基中。
7:30转染
12：30换液
转染细胞密度 80％，转染时间：40小时
screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=493 height=329 title="Click to iew full 80%转42hr 07.1.20.JPG (493 X 329)" border=0 align=absmiddle>
转染效率的最高峰是多少小时，那么沉默效果呢？什么时候检测WB和RT-PCR比较合适，是不是一般沉默效果的最高峰延迟于转染效果的高峰，一般延迟多少。
消化，pbs洗涤，（没加磷酸酶抑制剂）裂解细胞，提蛋白，定量，加loading，变性，分装冻存。
----------Ug/ul----+loading后
Cell--------5.42-------4.51
— --------4.21-------3.5
＋---------4.91-------4.09
64----------3.86-------3.21
56----------6.13-------5.10
67----------5.04-------4.19
= -----------6.07-----5.05
HER 2序列
M11730
Human tyrosine kinase-type receptor (HER2) mRNA, complete cds
gi|183986|gb|M11730.1|HUMHER2A[183986]
http://www.ncbi.nlm.nih.go/entrez/iewer.fcgi?db=nucleotide&al=183986
LOCUS HUMHER2A 4530 bp mRNA linear PRI 18-SEP-1995
DEFINITION Human tyrosine kinase-type receptor (HER2) mRNA, complete cds.
ACCESSION M11730
ERSION M11730.1 GI:183986
KEYWORDS tyrosine kinase.
SOURCE Homo sapiens (human)
ORGANISM Homo sapiens
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; ertebrata; Euteleostomi;
Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Primates; Haplorrhini;
Catarrhini; Hominidae; Homo.
REFERENCE 1 (bases 1 to 4530)
AUTHORS Coussens,L., Yang-Feng,T.L., Liao,Y.-C., Chen,E., Gray,A.,
McGrath,J., Seeburg,P.H., Libermann,T.A., Schlessinger,J.,
Francke,U., Leinson,A. and Ullrich,A.
TITLE Tyrosine kinase receptor with extensie homology to EGF receptor
shares chromosomal location with neu oncogene
JOURNAL Science 230 (4730), 1132-1139 (1985)
PUBMED 2999974
REFERENCE 2 (bases 1701 to 1719)
AUTHORS Ullrich,A.
JOURNAL Unpublished (1988)
COMMENT Original source text: Homo sapiens (clone: lambda-HER2-436) fetal
cDNA to mRNA.
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..4530
/organism="Homo sapiens"
/mol_type="mRNA"
/db_xref="taxon:9606"
/clone="lambda-HER2-436"
/de_stage="fetal"
mRNA <1..4530
/product="HER2 mRNA"
CDS 151..3918
/note="HER2 receptor"
/codon_start=1
/protein_id="AAA75493.1"
/db_xref="GI:306840"
/translation="MELAALCRWGLLLALLPPGAASTQCTGTDMKLRLPASPETHLD
MLRHLYQGCQQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEQGYLIAHNQRQPLQRLRI
RGTQLFEDNYALALDNGDPLNNTTPTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGLIQRNPQ
LCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRT
CAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALTYNT
DTFESMPNPEGRYTFGASCTACPYNYLSTDGSCTLCPLHNQETAEDGTQRCEKC
SKPCARCYGLGMEHLRERATSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPL
QPEQLQFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSFQNLQIRGRILHNGAYSLTLQGLGI
SWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFHTPWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECGEG
LACHQLCARGHCWGPGPTQCNCSQFLRGQECEECRLQGLPREYNARHCLPCHPE
CQPQNGSTCFGPEADQCACAHYKDPPFCARCPSGKPDLSYMPIWKFPDEEGACQ
PCPINCTHSCDLDDKGCPAEQRASPLTSISAGILLLGFGILIKRRQQKI
RKYTMRRLLQETELEPLTPSGAMPNQAQMRILKETELRKKLGSGAFGTYKGIWI
PDGENKIPAIKLRENTSPKANKEILDEAYMAGGSPYSRLLGICLTSTQLT
QLMPYGCLLDHRENRGRLGSQDLLNWCMQIAKGMSYLEDRLHRDLAARNLKSP
NHKITDFGLARLLDIDETEYHADGGKPIKWMALESILRRRFTHQSDWSYGTWE
LMTFGAKPYDGIPAREIPDLLEKGERLPQPPICTIDYMIMKCWMIDSECRPRFREL
SEFSRMARDPQRFIQNEDLGPASPLDSTFYRSLLEDDDMGDLDAEEYLPQQGF
FCPDPAPGAGGMHHRHRSSSTRSGGGDLTLGLEPSEEEAPRSPLAPSEGAGSDFDG
DLGMGAAKGLQSLPTHDPSPLQRYSEDPTPLPSETDGYAPLTCSPQPEYNQPDR
PQPPSPREGPLPAARPAGATLERAKTLSPGKNGKDFAFGGAENPEYLTPQGGAA
PQPHPPPAFSPAFDNLYYWDQDPPERGAPPSTFKGTPTAENPEYLGLDP"
old_sequence 1701..1719
/citation=[1]
ORIGIN Chromosome 17q21-q22.
1 aattctcgag ctcgtcgacc ggtcgacgag ctcgagggtc gacgagctcg agggcgcgcg
61 cccggccccc acccctcgca gcaccccgcg ccccgcgccc tcccagccgg gtccagccgg
121 agccatgggg ccggagccgc agtgagcacc atggagctgg cggccttgtg ccgctggggg
181 ctcctcctcg ccctcttgcc ccccggagcc gcgagcaccc aagtgtgcac cggcacagac
241 atgaagctgc ggctccctgc cagtcccgag acccacctgg acatgctccg ccacctctac
301 cagggctgcc aggtggtgca gggaaacctg gaactcacct acctgcccac caatgccagc
361 ctgtccttcc tgcaggatat ccaggaggtg cagggctacg tgctcatcgc tcacaaccaa
421 gtgaggcagg tcccactgca gaggctgcgg attgtgcgag gcacccagct ctttgaggac
481 aactatgccc tggccgtgct agacaatgga gacccgctga acaataccac ccctgtcaca
541 ggggcctccc caggaggcct gcgggagctg cagcttcgaa gcctcacaga gatcttgaaa
601 ggaggggtct tgatccagcg gaacccccag ctctgctacc aggacacgat tttgtggaag
661 gacatcttcc acaagaacaa ccagctggct ctcacactga tagacaccaa ccgctctcgg
721 gcctgccacc cctgttctcc gatgtgtaag ggctcccgct gctggggaga gagttctgag
781 gattgtcaga gcctgacgcg cactgtctgt gccggtggct gtgcccgctg caaggggcca
841 ctgcccactg actgctgcca tgagcagtgt gctgccggct gcacgggccc caagcactct
901 gactgcctgg cctgcctcca cttcaaccac agtggcatct gtgagctgca ctgcccagcc
961 ctggtcacct acaacacaga cacgtttgag tccatgccca atcccgaggg ccggtataca
1021 ttcggcgcca gctgtgtgac tgcctgtccc tacaactacc tttctacgga cgtgggatcc
1081 tgcaccctcg tctgccccct gcacaaccaa gaggtgacag cagaggatgg aacacagcgg
1141 tgtgagaagt gcagcaagcc ctgtgcccga gtgtgctatg gtctgggcat ggagcacttg
1201 cgagaggtga gggcagttac cagtgccaat atccaggagt ttgctggctg caagaagatc
1261 tttgggagcc tggcatttct gccggagagc tttgatgggg acccagcctc caacactgcc
1321 ccgctccagc cagagcagct ccaagtgttt gagactctgg aagagatcac aggttaccta
1381 tacatctcag catggccgga cagcctgcct gacctcagcg tcttccagaa cctgcaagta
1441 atccggggac gaattctgca caatggcgcc tactcgctga ccctgcaagg gctgggcatc
1501 agctggctgg ggctgcgctc actgagggaa ctgggcagtg gactggccct catccaccat
1561 aacacccacc tctgcttcgt gcacacggtg ccctgggacc agctctttcg gaacccgcac
1621 caagctctgc tccacactgc caaccggcca gaggacgagt gtgtgggcga gggcctggcc
1681 tgccaccagc tgtgcgcccg agggcactgc tggggtccag ggcccaccca gtgtgtcaac
1741 tgcagccagt tccttcgggg ccaggagtgc gtggaggaat gccgagtact gcaggggctc
1801 cccagggagt atgtgaatgc caggcactgt ttgccgtgcc accctgagtg tcagccccag
1861 aatggctcag tgacctgttt tggaccggag gctgaccagt gtgtggcctg tgcccactat
1921 aaggaccctc ccttctgcgt ggcccgctgc cccagcggtg tgaaacctga cctctcctac
1981 atgcccatct ggaagtttcc agatgaggag ggcgcatgcc agccttgccc catcaactgc
2041 acccactcct gtgtggacct ggatgacaag ggctgccccg ccgagcagag agccagccct
2101 ctgacgtcca tcgtctctgc ggtggttggc attctgctgg tcgtggtctt gggggtggtc
2161 tttgggatcc tcatcaagcg acggcagcag aagatccgga agtacacgat gcggagactg
2221 ctgcaggaaa cggagctggt ggagccgctg acacctagcg gagcgatgcc caaccaggcg
2281 cagatgcgga tcctgaaaga gacggagctg aggaaggtga aggtgcttgg atctggcgct
2341 tttggcacag tctacaaggg catctggatc cctgatgggg agaatgtgaa aattccagtg
2401 gccatcaaag tgttgaggga aaacacatcc cccaaagcca acaaagaaat cttagacgaa
2461 gcatacgtga tggctggtgt gggctcccca tatgtctccc gccttctggg catctgcctg
2521 acatccacgg tgcagctggt gacacagctt atgccctatg gctgcctctt agaccatgtc
2581 cgggaaaacc gcggacgcct gggctcccag gacctgctga actggtgtat gcagattgcc
2641 aaggggatga gctacctgga ggatgtgcgg ctcgtacaca gggacttggc cgctcggaac
2701 gtgctggtca agagtcccaa ccatgtcaaa attacagact tcgggctggc tcggctgctg
2761 gacattgacg agacagagta ccatgcagat gggggcaagg tgcccatcaa gtggatggcg
2821 ctggagtcca ttctccgccg gcggttcacc caccagagtg atgtgtggag ttatggtgtg
2881 actgtgtggg agctgatgac ttttggggcc aaaccttacg atgggatccc agcccgggag
2941 atccctgacc tgctggaaaa gggggagcgg ctgccccagc cccccatctg caccattgat
3001 gtctacatga tcatggtcaa atgttggatg attgactctg aatgtcggcc aagattccgg
3061 gagttggtgt ctgaattctc ccgcatggcc agggaccccc agcgctttgt ggtcatccag
3121 aatgaggact tgggcccagc cagtcccttg gacagcacct tctaccgctc actgctggag
3181 gacgatgaca tgggggacct ggtggatgct gaggagtatc tggtacccca gcagggcttc
3241 ttctgtccag accctgcccc gggcgctggg ggcatggtcc accacaggca ccgcagctca
3301 tctaccagga gtggcggtgg ggacctgaca ctagggctgg agccctctga agaggaggcc
3361 cccaggtctc cactggcacc ctccgaaggg gctggctccg atgtatttga tggtgacctg
3421 ggaatggggg cagccaaggg gctgcaaagc ctccccacac atgaccccag ccctctacag
3481 cggtacagtg aggaccccac agtacccctg ccctctgaga ctgatggcta cgttgccccc
3541 ctgacctgca gcccccagcc tgaatatgtg aaccagccag atgttcggcc ccagccccct
3601 tcgccccgag agggccctct gcctgctgcc cgacctgctg gtgccactct ggaaagggcc
3661 aagactctct ccccagggaa gaatggggtc gtcaaagacg tttttgcctt tgggggtgcc
3721 gtggagaacc ccgagtactt gacaccccag ggaggagctg cccctcagcc ccaccctcct
3781 cctgccttca gcccagcctt cgacaacctc tattactggg accaggaccc accagagcgg
3841 ggggctccac ccagcacctt caaagggaca cctacggcag agaacccaga gtacctgggt
3901 ctggacgtgc cagtgtgaac cagaaggcca agtccgcaga agccctgatg tgtcctcagg
3961 gagcagggaa ggcctgactt ctgctggcat caagaggtgg gagggccctc cgaccacttc
4021 caggggaacc tgccatgcca ggaacctgtc ctaaggaacc ttccttcctg cttgagttcc
4081 cagatggctg gaaggggtcc agcctcgttg gaagaggaac agcactgggg agtctttgtg
4141 gattctgagg ccctgcccaa tgagactcta gggtccagtg gatgccacag cccagcttgg
4201 ccctttcctt ccagatcctg ggtactgaaa gccttaggga agctggcctg agaggggaag
4261 cggccctaag ggagtgtcta agaacaaaag cgacccattc agagactgtc cctgaaacct
4321 agtactgccc cccatgagga aggaacagca atggtgtcag tatccaggct ttgtacagag
4381 tgcttttctg tttagttttt actttttttg ttttgttttt ttaaagacga aataaagacc
4441 caggggagaa tgggtgttgt atggggaggc aagtgtgggg ggtccttctc cacacccact
4501 ttgtccattt gcaaatatat tttggaaaac
EGFR
----------Ug/ul----+loading后---------ul------------ug
Cell--------5.42-------4.51------------5-------------22.55
— --------4.21-------3.5--------------6-------------21
＋---------4.91-------4.09-----------5-------------20.45
64----------3.86-------3.21----------6-------------19.26
56----------6.13-------5.10----------4------------20.4
67----------5.04-------4.19----------5--------------20.95
= -----------6.07-----5.05 -----------4------------20.5
t－EGFR+GAPDH 单倍量 64加少了点
p－EGFR+ b－actin双倍量：56加多了点。抗体一抗1：1000，二抗1：3000鼠。
人ErbB受体属于I型受体酪氨酸激酶(TK)家族。包括ErbB1(EGFR)、ErbB2(HER2)、ErbB3(HER3)和ErbB4(HER4)。癌症患者ErbB-1(EGFR)和ErbB-2(HER-2)受体通常过度表达或发生其它改变。目前已知人类表皮生长因子受体-2(ErbB-2、HER-2)是目前认识较为清楚的与乳腺癌关系密切的人类癌基因，它在乳腺癌中的高表达往往预示着易有淋巴结转移和肿瘤分化差，预后不佳。随着对HER-2研究的深入，它已经成为乳腺癌特异性治疗的靶分子之一。
c-erbB-2最早是由shih从大鼠的神经胶质瘤中分离得到的，c-erbB-2蛋白分子量为185KD-190KD，称P185，其编码的蛋白由胞外区、跨膜区、胞内区组成，胞外区存在两个半胱氨酸残基丰富区，起着激活配体和稳定蛋白构型的作用。胞内区具有酪氨酸激酶活性和ATP结合位点，是c-erbB-2蛋白的功能区。
c-erbB-2定位于人染色体17q21上，Yamammoto研究发现：人类c-erbB-2的转录主要起始于两个位置-69位和+1位。一个由六个GGA重复序列构成的起始子定位-68位与-45位之间，并特异性地决定由-69位起始的基因转录；另一个起始子，是在-25位存在一个TATA盒子，它决定+1位的基因转录。这两个不同的转录起始子，各自独立受不同的顺式作用元件调控。在某些肿瘤细胞中存在着能够特异性地与c-erbB-2启动子结合的DNA结合结合蛋白，促进其转录，细胞增殖，细胞恶性转化，并与人类肿瘤发生密切相关。c-erbB-2表达的调控是一个非常复杂的问题，除上述作用以外，c-erbB-2还受抑癌基因、病毒基因产物在转录水平调控，以及某些激素的转录后调控。
A549资料
ATCC® Number: CCL-185™
http://www.atcc.org/common/catalog/numSearch/numResults.cfm
（缩略图，点击图片链接看原图）
GAPDH－RT-PCR
Primer1:5' CAC TgA CAC gTT ggC AgT gg 3' Tm 61.9
Primer2:5' CAT ggA gAA ggC Tgg ggC TC 3' Tm 64.0
以上引物为上海生工合成
反应体系组成
10Xone step RNA PCR buffer 5ul
Mgcl2(25mM) 10ul
dNTP Mixture(10mM) 5ul
RI(40U/ul) 0.5ul
AM RTase XL(5U/ul) 1ul
AM Optimized Taq(5U/ul) 1ul
Primer1(20uM) 2ul
Primer2(20uM) 2ul
RNA 3ul
RNase Free dH2O 20.5ul
反应条件为:
50℃ 30min
94℃ 2min
35cycles
94℃ 30sec
60℃ 30sec
72℃ 30sec
再延伸
72℃ 7min
4℃ 保存
HER2
sense:CACCTACAACACAGACACGTTTGA
probe:CCGGTATACATTCGGCGCCAGCT
reerseTCCCACGTCCGTAGAAAGGTA
sense:ACAAAAGCGACCCATTCAGAGA
probe:CAGCAATGGTGTCAGTATCCAGGCTTTG
reerse:AAGTAAAAACTAAACAGAAAAGCACTCTGT
给你设计的用于taqman法的引物探针。第一对比较好一些。
草根
你给的这个GAPDH序列没有探针，是否是用于sybr green法的？
我帮你设计的是taqman探针法的。探针法比sybr green法贵一些，不过好做些，效果也好些。
所以我没有帮你比对这个序列了。等你确定了你的方法之后再说。
首要条件是这对引物要跨内含子。
chenpeng599205
稀释传代按1：5~1：10，操作过程大体是这样的：先转染，24~48小时后稀释传代，等细胞贴壁后加入G418即可，然后持续培养，每三天换一次液，同时加G418，直至克隆形成。
关于G418浓度的问题，首先用空白细胞，找出那个使细胞二三天开始死，一周左右死光的浓度，按这个浓度加到转染后的细胞内，不必再提高，这个浓度叫做筛选浓度，通常400~600ug/ml.等挑取了单克隆以后，由于所有的细胞都是稳定转染的细胞了，所以仅用一个维持浓度就可以了，通常 200~400ug/ml，当然你也可以人为地提高一下G418浓度，使筛选条件更加严格。
以上是一点建议，希望对你有帮助。
您好!
欢迎您与公司合作,从序列分析的结果来看,您的这个基因很难做到同时干扰HER1和HER2（两基因均为人源）.序列分析结果在附件.
我比对了一下her1和her2基因的mRNA的序列。发现不可能设计出能够同时干扰这两个基因的siRNA. 因为他们的同源性还没有达到那么高。
her1的accession no.
transcript ariant 1------------2------------------3---------------4
-----------------NM_005228----NM_201282--- NM_201283---- NM_201284
BC094761(complete cds)
her2的accession no.
transcript ariant 1------------2
-------------NM_004448----NM_001005862
M11730(complete cds)
western blot
http://www.dxy.cn/bbs/post/iew?bid=65&id=5936631&sty=1&tpg=1&ppg=1&age=-1#5936631
探针：
http://www.ncbi.nlm.nih.go/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=probe
EGFR
HER2
GAPDH
expression－－－－－－－silence－－－－－－－－iriation
检测表达－－－－－－－沉默－－－－－－－－－变异
（缩略图，点击图片链接看原图）
RNA干扰技术抑制非小细胞肺癌表皮生长因子受体的表达
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【英文篇名】 Effects of RNA interference on epidermal growth factor receptor expression in SPC-A-1 cells
【作者】 张敏; 张新; 白春学; 陈杰; MinQ. Wei;
【英文作者】 ZHANG Min *; ZHANG Xin; BAI Chun-xue; CHEN Jie; MinQ. Wei. *Institute of Respiratory Diseases; Zhongshan Hospital; Fudan Uniersity; Shanghai 200032; China;
【作者单位】 复旦大学附属中山医院呼吸疾病研究所; 澳大利亚布里斯班昆士兰大学药物研究室; 200032上海;
【刊名】 中华内科杂志 , Chinese Journal of Internal Medicine, 编辑部邮箱 2004年 05期
期刊荣誉：中文核心期刊要目总览 ASPT来源刊 中国期刊方阵 CJFD收录刊
【关键词】 RNA干扰; 癌; 非小细胞肺; 受体; 表皮生长因子;
【英文关键词】 RNA interference; Carcinoma; non-small-cell lung; Receptor; epidermal growth factor;
【摘要】 目的 观察RNA干扰技术是否能有效抑制非小细胞肺癌 (NSCLC)细胞株SPC A 1细胞表皮生长因子受体 (EGFR)的表达。方法 体外化学合成EGFR序列特异性双链RNA(dsRNA) ,与Lipofectamine 2 0 0 0结合后转染细胞 (分 4个组 ,A组 :加入无血清DMEM 5 0 0 μl;B组 :加入Lipofectamine2 0 0 0稀释液 2 5 0 μl及无血清DMEM 2 5 0 μl;C组 :加入非特异性dsRNA/Lipofectamine复合物 5 0 0 μl;D组 :加入dsRNA EGFR/Lipofectamine复合物 5 0 0 μl) ,用Westernblot和流式细胞仪检测EGFR表达。流式细胞仪测细胞周期 ,结合集落形成、化疗敏感性分析观察SPC A 1细胞生物学特性的改变。结果 与A组比较 ,D组EGFR数量减少了 71 31% (P <0 0 0 1) ,B组和C组分别降低了 9 0 %和 16 2 % (P >0 0 5 )。与A组比较 ,D组细胞生长抑制了 78 3% ,集落形成抑制了 6 6 8%。D组G0 G...
【英文摘要】 Objectie To inestigate whether RNA interference (RNAi) induced by small interference RNA (siRNA) could suppress epidermal growth factor receptor (EGFR) expression in non-small-cell lung carcinoma (NSCLC) cells. Methods SPC-A-1 cells were transfected using chemically synthesized double stranded RNA (dsRNA) formulated with Lipofectamine 2000. The EGFR numbers were determined by both Western blot and flow cytometry. The antiproliferatie effects of dsRNA-EGFR were assessed using cell counts and colony assay...
【基金】 上海市科技发展基金资助项目 (0 2DJ14 0 2 7)
【DOI】 cnkiSSN:0578-1426.0.2004-05-007
RNAi旧贴整理
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archie/post/1451562_0.html
电泳60 15min
120 在60min
EGFR分子量170KD
湿转3小时
HER2
序列1：
CCCTGAGATCCCAGCGCTGTT
Pubmed上probe连接：
http://www.ncbi.nlm.nih.go/genome/probe/reports/probereport.cgi?uid=123064&term=HER2
原文：“附件her2”
序列2：
请你们帮忙设计
accession no：M11730(complete cds)
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－
EGFR+HER2双干扰：
序列3：从a或者b中挑一条
a. 靶序列：TCTACATGATCATGGTCAA；
正义链(5'-3')： UCUACAUGAUCAUGGUCAA dTdT
反义链(3'-5')： dTdT AGAUGUACUAGUACCAGUU
b. GUC UAC AUG AUC AUG GUC Adtdt
UGA CCA UGA UCA UGU AGA Cdtdt
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－
EGFR：
序列4：
erbB1-3 5 -CACAGUGGAGCGAAUUCCUTT-3
3 -TTGUGUCACCUCGCUUAAGGA-5
原文：“附件EGFR”或者“图片EGFR”中的第三条erbB1-3序列。
参考文献
Title: Small interfering RNAs suppress the expression of endogenous and GFP-fused epidermal growth factor receptor (erbB1) and induce apoptosis in erbB1-oerexpres sing cells
Author: Nagy P, Arndt-Join DJ, Join TM
Source: EXPERIMENTAL CELL RESEARCH 285 (1): 39-49 APR 15 2003
Document Type: Article
Language: English
Cited References: 50 Times Cited: 38 IF 4.8
Abstract: Deregulated and excessie expression of epidermal growth factor receptor (EGFR or erbB1), a transmembrane receptor tyrosine kinase specific for the epidermal growth factor (EGF), is a feature and/or cause of a wide range of human cancers, and thus inhibition of its expression is potentially therapeutic. In RNA interference (RNAi), duplexes of 21-nucleotide RNAs (small interfering RNA, siRNA) corresponding to mRNA sequences of particular genes are used to efficiently inhibit the expression of the target proteins in mammalian cells. Here we show that by using RNAi the expression of endogenous erbB1 can be specifically and extensiely (90%) suppressed in A431 human epidermoid carcinoma cells. As a consequence, EGF-induced tyrosine phosphorylation was inhibited and cell proliferation was reduced due to induction of apoptosis. We established an inerse correlation between the leel of expressed erbB1 and EGF sensitiity on a cell-by-cell basis using flow cytometry. A431 cells expressing endogenous erbB1 were transfected with erbB1 fused C-terminally to enhanced green fluorescent protein (EGFP). Selectie inhibition of the expression of the fusion protein was achieed with an siRNA specific for the EGFP mRNA, whereas the erbB1-specific siRNAs inhibited the expression of both molecules. siRNA-mediated inhibition of erbB I and other erbB tyrosine kinases may constitute a useful therapeutic approach in the treatment of human cancer. (C) 2003 Elseier Science (USA). All rights resered.
Author Keywords: EGF receptor; erbB1; inhibition of proliferation; RNA interference
KeyWords Plus: TYROSINE KINASE INHIBITOR; EGF RECEPTOR; CANCER-CELLS; MAMMALIAN-CELLS; PHASE-I; SIGNAL-TRANSDUCTION; SQUAMOUS CARCINOMA; GENE-EXPRESSION; ZD1839 IRESSA; LUNG-CANCER
Addresses: Join TM (reprint author), Max Planck Inst Biophys Chem, Dept Mol Biol, Fassberg 11, D-37077 Gottingen, Germany
Max Planck Inst Biophys Chem, Dept Mol Biol, D-37077 Gottingen, Germany
Publisher: ACADEMIC PRESS INC ELSEIER SCIENCE, 525 B ST, STE 1900, SAN DIEGO, CA 92101-4495 USA
Subject Category: Oncology; Cell Biology
IDS Number: 669NA
ISSN: 0014-4827
DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为1~10ug/ml。4摄氏度避光保存，无需消毒！
WB加2抗
均1：3000，加3ml牛奶
EGFR 兔 4度冰箱 灰色那支
HER2 兔
－－－－－－－－－－－
GAPDH和b－actin和p－EGFR 为鼠 －20度冰箱 黄色那支
牛叉～～～
HER2和EGFR具有80%同源性，HER 2基因copy数也可以预测EGFR tki疗效。
J Clin Oncol. 2005 Aug 1;23(22):5007-18. Related Articles, Links
Increased HER2 gene copy number is associated with response to gefitinib therapy in epidermal growth factor receptor-positie non-small-cell lung cancer patients.
Cappuzzo F, arella-Garcia M, Shigematsu H, Domenichini I, Bartolini S, Ceresoli GL, Rossi E, Ludoini , Gregorc , Toschi L, Franklin WA, Crino L, Gazdar AF, Bunn PA Jr, Hirsch FR.
Uniersity of Colorado Cancer Center, Department of Medicine and Pathology, Aurora, CO 80010, USA.
PURPOSE: In non-small-cell lung cancer (NSCLC), response to tyrosine kinase inhibitors (TKIs) is significantly associated with the presence of increased copy number and/or actiating mutations of the epidermal growth factor receptor gene (EGFR). Preclinical data indicate that HER2, a member of the EGFR family, could enhance TKI sensitiity. PATIENTS AND METHODS: HER2 gene copy numbers per cell were ealuated by fluorescent in situ hybridization (FISH) in 102 NSCLC patients treated with gefitinib, and preiously ealuated for EGFR status by FISH, immunohistochemistry, and presence of mutations. RESULTS: Patients with HER2 high copy number (high polysomy and gene amplification [HER2 FISH positie]) represented 22.8% of patients, and compared with patients with no or low gain (HER2 FISH negatie), had significantly better objectie response (OR, 34.8% 6.4%; P = .001), disease control rate (DCR, 56.5% 33.3%; P = .04), time to progression (TTP, 9.05 2.7 months; P = .02), and a trend toward longer oerall surial (OS, 20.8 8.4 months; P = .056). HER2 protein expression inestigated by immunohistochemistry was positie in only fie of 72 (7%) patients analyzed and all 89 patients tested by DNA sequencing were negatie for mutations in HER2 exon 20. Patients with HER2 FISH-positie tumors displaying increased expression of EGFR protein, gene gain, or mutations (EGFR positie) had a significantly better OR, DCR, TTP, and OS than patients negatie for both receptors. CONCLUSION: Increased copy number of the HER2 gene is associated with gefitinib sensitiity in EGFR-positie patients, supporting use of HER2 FISH analysis for selection of patients for TKI therapy.
提蛋白。
弃去上清，保留细胞沉淀，加入相应量的蛋白酶抑制剂（0.5ul）及磷酸酶抑制剂，最后加进相应量的细胞裂解液（按每106细胞加入100微升计）
特别注意：推荐用RIPA，液体量一定要够，以防太多核酸难以处理。一般一瓶25平方厘米的细胞用200微升。
轻弹EP管，使细胞充分裂解。置0度冰浴20min。
wincu原创
细胞裂解液用什么配方？
RNAi中，靶蛋白的WB图片质量要求很高哦。
freecell wrote:
细胞裂解液用什么配方？
RNAi中，靶蛋白的WB图片质量要求很高哦。
RAPI,WB做得不好。干扰效果也不明显，老兄你做得怎样。
－－－－－－
酶标仪蛋白定量：
标准曲线
PBS－－15－－14－－13－－12－－11－－10－－9－－8 ul
BAS－－0－－ 1－－－ 2--－3--－－4--－－5--－－6－－7
考马思蓝 290ul
－－－
sample：
PBS 14ul
sample 1ul
考马思蓝 290ul
浓度接近1ug/ul
----------
加5×loading，变性10min
－－－－
加样顺序：
maker，HT29，—，HER 2 12，HER 2 34,HT29-56，56，64，67，＋
[序列名：siNM_004448_004]
靶序列：GCATACGTGATGGCTGGTG
正义链(5'-3')： GCAUACGUGAUGGCUGGUG dTdT
反义链(3'-5')：dTdT CGUAUGCACUACCGACCAC
[序列名：siNM_004448_005]
靶序列：GGAAACCTGGAACTCACCTAC
正义链(5'-3')： GGAAACCUGGAACUCACCUAC dTdT
反义链(3'-5')：dTdT CCUUUGGACCUUGAGUGGAUG
[序列名：siNM_004448_006]
靶序列：GTCTACATGATCATGGTCAA
正义链(5'-3')： GUCUACAUGAUCAUGGUCAA dTdT
反义链(3'-5')：dTdT CAGAUGUACUAGUACCAGUU
[序列名：siNM_004448_007]
靶序列：CACAGTGGAGCGAATTCCT
正义链(5'-3')： CACAGUGGAGCGAAUUCCU dTdT
反义链(3'-5')：dTdT GUGUCACCUCGCUUAAGGA
b-actin
鼠
－20度下格
1：1000
GAPDH
鼠
－20度上格
1：200－500
EGFR
单抗：鼠
1：1000
多抗：兔
HER2
兔
1：1000
一抗：
bactin 1:1000
GAPDH 1:200-500
t－EGFR 多抗 4度冰箱
p－EGFR
HER2 1:1000 －20度冰箱下格
WB加2抗
均1：3000，加3ml 5％脱脂牛奶TPBS
EGFR
多抗：兔 4度冰箱 灰色那支
单抗：鼠
HER2 兔
－－－－－－－－－－－
GAPDH和b－actin和p－EGFR 为鼠 －20度冰箱 黄色那支
1. 准备无血清无抗生素培养基8×20
2. 8×2＝14个1.5mlEP管，每个加培养基250ml。
3.加质粒
＋ ul数＝4/0.81=4.93
— ul数＝4/0.703=5.68
56 ul数＝4/1.02=3.9
64 ul数＝4/1.03=3.88
67 ul数＝4/1.23=3.25
12 ul数=4/0.1425=28
34 ul数=4/0.14=28
cell
4. 加lipofectamine 2000 各10ul
5.等10min
6.混合质粒和lipofectamine 20－25min
7.细胞换液各1500ul。（转染时细胞融合度约80％）
8.500ul质粒转染试剂混合物加入培养基中。
7:30转染
12：30换液
一抗：
bactin 鼠，－20度冰箱上格，1:1000
GAPDH 鼠， －20度冰箱上格，1:200-500
t－EGFR 多抗 兔 4度 1：500冰箱
p－EGFR
HER2 兔 1:1000 －20度冰箱下格
1500ml 牛奶
转自cyanoluweidong
forem
一天，一只兔子在山洞前写论文。
一只狼过来，问兔子：‘你在写什么？”
答：“论文”
狼问：“你的论文的主题是什么？”
答：“＜论兔子如何吃掉狼＞”。
狼听了哈哈大笑。
兔子说，我写的论文大部分稿子在洞里，我把道理写的很清楚。
狼想看看兔子的论文是怎么写的。于是兔子把狼领进山洞。
过了一会，兔子独自走出山洞。
兔子继续在山洞前写它的论文。
一只狐狸过来，问：“你在写什么？”
答：“我在写论文”。
“论文的主题是什么？”
答：“论兔子如何吃掉狐狸”。
向来狡猾的狐狸也笑了。说：“这怎么可能呢”
兔子说：“我写的大部分稿子还在洞里，我把道理写的很清楚。”
狐狸想去看看兔子的论文是怎么写的，于是兔子把狐狸领进山洞。
过了一会儿， 兔子独自一个走出山洞。
最后，在山洞里一只狮子在几堆白骨之间，满意地一边剔着牙，
一边阅读兔子交给它的论文的提要：“一个动物，能力大小并不重要，关键看你的导师是谁!!
此笑话仅供大家一乐
haahahahahhahahahahhahahahhhahhahahh
真牛叉～～～
肿瘤患者预后判断：AG1478对3种tH,细胞肺癌细胞系的生长抑制作用☆
肿瘤患者预后判断：AG1478对3种非小细胞肺癌细胞系的生长抑制作用☆.pdf (117.47k)
siRNA
006_BIEH
EGFR+HER2双干扰：
序列3：
靶序列：GTCTACATGATCATGGTCAA；
-----------------------------------------------
007_64
EGFR：
序列4：
erbB1-3
5 -CACAGTGGAGCGAATTCCT-3
+,-荧光，56
64，biEH，H2
http://www.dxy.cn/bbs/post/iew?bid=45&id=8289125&sty=1&tpg=1&age=0
严新气功和akt，ERK通路的关系
复苏lr乳腺癌细胞，her2高表达
SKBR-3
---------------------EGFR，her2
A549，腺癌，
lrd，腺癌，
spc-A-1，腺癌，肺腺癌胸膜转移细胞系
L-78，鳞癌
h460，大细胞肺癌
－－－－－－－－－－－－－－
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肺腺癌SPC-A-1细胞表皮生长因子受体表达水平对其增殖的影响
Antitumor effect of epidermal growth factor receptor gene silencing
<<中华结核和呼吸杂志 >>2005年05期
张敏 , 白春学 , 张新 , 高磊 , 毛翎 , 陈杰 , ZHANG Min , BAI Chun-xue , ZHANG Xin , GAO Lei , MAO Ling , CHEN Jie
目的探讨采用体外化学合成的针对表皮生长因子受体(EGFR)设计的双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA),是否能诱导肺非小细胞肺癌(NSCLC)细胞出现序列特异性基因沉默,及抑制EGFR基因表达后NSCLC细胞的生物学特征.方法体外合成EGFR序列特异性dsRNA(dsRNA-EGFR),结合脂质体2000转染肺腺癌SPC-A-1细胞,用荧光显微镜及流式细胞仪测定转染细胞的EGFR受体数量;适时定量聚合酶链反应检测其EGFR基因表达水平.采用集落形成试验检测SPC-A-1细胞的增殖和集落形成能力.建立裸鼠肿瘤模型,计算肿瘤抑制率.结果 dsRNA-EGFR可使EGFR在蛋白水平表达下降71.3%、基因水平表达下降50.0%,SPC-A-1细胞集落形成下降66.8%,并显著抑制在体肿瘤生长,肿瘤抑制率为75.0%.结论 dsRNA-EGFR可序列特异性下调NSCLC细胞EGFR在基因及蛋白水平的表达,有效抑制肿瘤生长.
阿霉素对不同C-erbB-2表达水平肺腺癌细胞株生长的影响
The effect of doxorubicin on human lung adenocarcinoma cell lines with the expression of C - erbB - 2
<<南通大学学报（医学版） >>2006年02期
唐剑英 , 李小村 , 赵弘卿 , 张熔熔 , 朱晓莉 , TANG Jianying , LI Xiaocun , ZHAO Hongqing
目的:研究阿霉素对体外培养不同C-erbB-2表达水平肺腺癌细胞增殖能力和细胞周期的影响.方法:采用集落形成实验检测阿霉素对人肺腺癌细胞体外增殖能力的影响,采用SABC法检测阿霉素对体外培养人肺腺癌细胞系C-erbB-2表达水平的影响,采用流式细胞术检测阿霉素对体外培养肺腺癌细胞生长周期的影响.结果:阿霉素可显著抑制3株人肺腺癌细胞的生长,并可使SPC-A-1和LTEP-a-2肺腺癌细胞系C-erbB-2的表达下降,在SPC-A-1和LTEP-a-2肺腺癌细胞系,G2-M期百分率明显升高,而在A549肺腺癌细胞系则可见明显的凋亡峰.结论:阿霉素抑制肺腺癌细胞株SPC-A-1和LTEP-a-2的生长机制可能与降低C-erbB-2表达引起肺腺癌细胞G2阻滞有关,其抑制肺腺癌细胞株A549生长则可能与诱导细胞凋亡有关.
C-erbB-2基因在人肺腺癌细胞表达与药物治疗关系的研究
The study on the relationship between expression of C-erbB-2 oncogene in non-small cell lung cancer and anticarcinogens treatment
<<现代医学 >>2004年06期
朱晓莉 , 林勇 , 唐剑英 , 张祖贻
目的观察紫杉醇、阿霉素和α-干扰素对不同C-erbB-2表达水平的人肺腺癌细胞系增殖能力的影响,探讨C-erbB-2基因和抗癌药物敏感性的关系.方法采用免疫组化方法检测C-erbB-2基因在肺癌细胞株(SPC-A-1、LTEP-α-2和A549)中的表达,观察紫杉醇、阿霉素及α-干扰素干预前后3株肺腺癌细胞系中C-erbB-2基因表达率的变化;采用四氮唑盐(MTT)比色法检测抗癌药物对人肺腺癌细胞体外增殖能力的影响,计算相应IC50值;应用集落形成试验检测药物对肺腺癌细胞集落形成能力的影响;结合流式细胞术定量分析药物干预前后各细胞系DNA含量的变化.结果SPC-A-1、LTEP-α-2和A549 3株肺腺癌细胞系均有不同水平C-erbB-2基因的表达.紫杉醇对低表达C-erbB-2基因的SPC-A-1肺腺癌细胞系的抗增殖作用明显强于高表达C-erbB-2基因的A549和LTEP-α-2肺腺癌细胞系,阿霉素对具有不同C-erbB-2表达水平的3株人肺腺癌细胞系均较敏感,α-干扰素对3株肺腺癌细胞均有一定的抑制作用,但较弱.在SPC-A-1细胞株应用阿霉素和紫杉醇后、LTEP-α-2细胞株应用阿霉素后,其C-erbB-2基因的表达率明显减低,但A549肺腺癌细胞系C-erbB-2表达率的变化无统计学差异.阿霉素和紫杉醇治疗后SPC-A-1和LTEP-α-2肺腺癌细胞系的G2-M期百分率明显升高,而A549肺腺癌细胞系表现为S期的百分率升高明显,α-干扰素对3株肺腺癌细胞系的细胞周期影响不大.结论化疗耐药可能与C-erbB-2基因的高表达有关,C-erbB-2基因的检测可作为非小细胞肺癌患者选择个体化治疗方案的指标.
来RNAi主任的专业博客里灌灌水，不介意吧，希望新年心想事成，RNAi研究出成果来，呵呵。
珍珍牛叉～～
死细胞，活细胞
不同细胞系
不同时间取蛋白。（EGFR半衰期）
url wrote:
来RNAi主任的专业博客里灌灌水，不介意吧，希望新年心想事成，RNAi研究出成果来，呵呵。
欢迎ur和东哥，多多指教。
肉眼
活 100ul
＋，－，56，64，bi，h2
7，2，4，4，4，4
7，2，2，2，4，4
56，64多稀释了一倍
死 50ul
＋，－，56，64，bi，h2
1.5，1.5，4，2，1，1
http://pdos.csail.mit.edu/scigen/
哈哈哈
b-actin －20度冰箱上格，1：3000
1. 准备无血清无抗生素培养基12×20
2. 5×2＝10个1.5mlEP管，每个加培养基500ml。
3.加质粒
＋ ul数＝8/0.81=10
— ul数＝4/0.703=11
56 ul数＝4/1.02=10
4. 加lipofectamine 2000 各20ul
5.等10min
6.混合质粒和lipofectamine 20－25min
7.细胞换液各1500ul。（转染时细胞融合度约80％）
8.500ul质粒转染试剂混合物加入培养基中。
7:30转染
12：30换液
厉害，偶大多看8 懂
转染4种肺癌细胞并观察转染效率
spc－a－1腺癌的转染效率最高，转染试剂毒性耐受能力最好。
针对HER2/neu的siRNA对非小细胞肺癌细胞生长的抑制作用
任新玲 钱桂生 鲍炜 付海京 贾林涛 张瑞 王涛 许彦鸣 杨安钢
摘 要：目的:构建针对HER2/neu的RNA干涉载体,观察对HER2/neu表达抑制及抑制后对非小细胞肺癌生长的影响. 方法:设计和合成长度为64nt的脱氧寡核苷酸链,退火互补成双链,克隆至pSUPER质粒载体,转化DH5α菌株,提取质粒,转染过表达HER2/neu的肺腺癌细胞系SPC-A-1,RT-PCR检测HER2/neu的mRNA表达,Western blot和间接免疫荧光法检测HER2/neu的蛋白表达,FCM分析细胞周期变化,MTT法观察细胞生长. 结果:肺腺癌细胞系SPC-A-1存在HER2/neu过表达;成功构建了HER2/neu特异性RNA干涉载体pSUPER-siHER2;瞬时转染SPC-A-1细胞,HER2/neu的mRNA及蛋白表达均降低;G1期细胞较亲代增加9.9%;肿瘤细胞增殖速度减慢(P＜0.05). 结论:成功构建了HER2/neu RNA干涉载体,转染后可有效降低肺腺癌细胞系SPC-A-1 HER2/neu的mRNA转录及蛋白水平表达,阻滞转染细胞于G1期,造成转染细胞生长速度减慢,这有望为肺癌基因治疗提供一种选择手段.
关键词：siRNA;RNA干涉;癌,非小细胞肺;HER2/neu
分类号：R734.2 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2006)09-0828-04
Inhibition of tumor growth of non-small cell lung cancer by small interfering RNA targeting to HER2/neu gene
REN Xin-Ling QIAN Gui-Sheng BAO Wei FU Hai-Jing JIA Lin-Tao ZHANG Rui WANG Tao XU Yan-Ming YANG An-Gang
基金项目：国家重大基础研究计划项目"973"(2004CB518805);教育部"长江学者和创新团队发展计划"项目(IRT0459)
作者简介：任新玲.博士生(导师钱桂生),主治医师,讲师.Tel029)84774386 Email:majrenxl@fmmu.edu.cn
作者简介：杨安钢.Tel029)84774528 Email:agyang@fmmu.edu.cn 通讯作者
作者单位：任新玲（第三军医大学新桥医院全军呼吸病研究所,重庆,400037）
钱桂生（第三军医大学新桥医院全军呼吸病研究所,重庆,400037）
鲍炜（第四军医大学基础部免疫学教研室,陕西,西安,710033）
付海京（第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室,陕西,西安,710033）
贾林涛（第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室,陕西,西安,710033）
张瑞（第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室,陕西,西安,710033）
王涛（第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室,陕西,西安,710033）
许彦鸣（第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室,陕西,西安,710033）
杨安钢（第四军医大学基础部免疫学教研室,陕西,西安,710033）
参考文献：
[1]Tsai CM,Chang KT.Interrelationship between cellular nucleotide excision repair,cisplatin cytotoxicity and EGFR in NSCLC[J].J Cancer Res,2000,91(2):213-222.
[2]Atalay G,Cardoso F,Awada A,et al.Noel therapeutic strategies targeting the epidermal growth factor receptor (EGFR) family and its downstream effectors in breast cancer[J].Ann Oncol,2003,14(9):1346-1363.
[3]Turken O,Kunter E,Cermik H,et al.Prealence and prognostic alue of c-erbB2 expression in non-small cell lung cancer (NSCLC)[J].Neoplasma,2003,50(4):257-261.
[4]Perez-Soler R.HER1/EGFR targeting:Refining the strategy[J].Oncologist,2004,9(1):58-67.
[5]Ma J,Kahwaji CI,Ni Z,et al.Effects of simulated micrograity on arterial nitric oxide synthese and nitrate and nitrite content[J].J Appl Physiol,2003,94(1):83-92.
[6]Zhao J,Zhang LH,Jia LT,et al.Secreted antibody/granzyme B fusion protein stimulates selectie killing of HER2-oerexpressing tumor cells[J].J Biol Chem,2004,279(20):21343-21348.
[7]Krug LM,Miller A,Patel J,et al.Randomized phase II study of weekly docetaxel plus trastuzumab ersus weekly paclitaxel plus trastuzumab in patients with preiously untreated adanced non small cell lung carcinoma[J].Cancer,2005,104(10):2149-2155.
[8]Clamon G,Herndon J,Kern J,et al.Lack of trastuzumab actiity in non small cell lung carcinoma with oerexpression of erb-B2:39810:A phase II trial of Cancer and Leukemia Group B[J].Cancer,2005,103:1670-1675.
[9]Milhaet O,Gary DS,Mattson MP.RNA interference in biology and medicine[J].Pharmacol Re,2003,55(4):629-648.
[10]Scherr M,Battmer K,Schuhheis B,et al.Stable RNA interference (RNAi)and an option for anti-bcr-abl therapy[J].Gene Ther,2005,12(1):12-21.
[11]Wohlbold L,an der Kuip H,Miething C,et al.Inhibition of berabl gene expression by small interfering RNA sensitizes for imatinib mesylate(ST1571)[J].Blood,2003,102:2236-2239.
[12]DaRoehaW D,Otsu K,Teixeira SM,et al.Tests of cytoplasmic RNA interferece(RNAi)and construction of a tetracyclineinducible T7 promoter system in Trypanosome cruzi[J].Mol Biochem Parasitol,2004,133(2):175-186.
[13]Sui GCH,Soohoo C,Afar EB,et al.A DNA ector-based RNAi technology to suppres gene expresion in mammalian cells[J].PNAS,2002,99:5515-5520.
[14]Brummelkamp TR,Bemards R,Agami R,et al.A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells[J].Science,2002,296:550-553.
RNA干扰技术抑制非小细胞肺癌表皮生长因子受体的表达
Effects of RNA interference on epidermal growth factor receptor expression in SPC-A-1 cells
<<中华内科杂志 >>2004年05期
张敏 , 张新 , 白春学 , 陈杰 , MinQ. Wei
目的观察RNA干扰技术是否能有效抑制非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株SPC-A-1细胞表皮生长因子受体(EGFR)的表达.方法体外化学合成EGFR序列特异性双链RNA(dsRNA),与Lipofectamine 2000结合后转染细胞(分4个组,A组:加入无血清DMEM 500 μl;B组:加入Lipofectamine 2000稀释液250 μl及无血清DMEM 250 μl;C组:加入非特异性dsRNA/Lipofectamine复合物500 μl;D组:加入dsRNA-EGFR/Lipofectamine复合物500 μl),用Western blot和流式细胞仪检测EGFR表达.流式细胞仪测细胞周期,结合集落形成、化疗敏感性分析观察SPC-A-1细胞生物学特性的改变.结果与A组比较,D组EGFR数量减少了71.31％(P<0.001),B组和C组分别降低了9.0％和16.2％(P>0.05).与A组比较,D组细胞生长抑制了78.3％,集落形成抑制了66.8％.D组G0-G1期细胞百分数较A组增加了17.48％,D组进入S期的细胞百分数较A组减少了19.20％.据Origin 6.0计算的IC50,dsRNA-EGFR可将细胞对顺铂的敏感性提高约7倍.结论 dsRNA-EGFR可有效抑制SPC-A-1细胞EGFR表达,将更多的细胞阻滞在G0-G1期,抑制细胞增生,提高细胞对顺铂的敏感性,RNA干扰技术为NSCLC基因治疗提供了新策略
免疫组化
转染
提质粒
筛选
铺板
流式细胞仪检测细胞凋亡
但最好还是用Annexin -PI染色法，可以分辨早期凋亡和晚期凋亡，我们用的试剂盒是美国的，大概2800元/100份。
1、流式细胞仪（Anexin /PI）双染定量检测凋亡结果，是根据单染还是双染来区分凋亡和死亡细胞的，你凭肉眼观察很难区分的。
2、你的离心时间稍短，通常细胞离心最好是10分钟，特别是凋亡检测，需把所有的细胞及碎片都沉淀下来。
3、流式的细胞不需要调整细胞浓度，机器取样时自动计数。
－－－－－－
1.是的，问题很不标准，我想“为何流式细胞仪检测凋亡细胞效率这么低？” 可能更合适。
2.因为流式相对较为昂贵，我之前用MTT、Hoechst 33342/PI、DNA ladder实验来确定药物浓度、时间曲线，明确凋亡存在，在两次流式结果不理想（凋亡细胞总体比例比较低<1%） 后，曾经怀疑试剂的问题，但是我用流式细胞仪分析凋亡的试剂染了几张片子，感觉还可以（Annexin 绿色荧光/PI红色荧光），凋亡细胞数目绝对不止1%。
3.步骤很简单：
把处理的细胞消化、中和、离心（1100转/min，5min）、PBS 洗2遍，
离心后都是直接倒掉上清的（而不是吸取上清的，会有问题吗？室温而不是在4度，是否会影响？）
２５０ｕｌ结合缓冲液重悬（没有调整细胞浓度？？）， 取100ul加入Annexin 5ul/PI 10ul避光室温15min后加入PBS 400ul 上机。
送标本太迟，改做细胞周期。
iseeyou wrote:
流式细胞仪检测细胞凋亡
但最好还是用Annexin -PI染色法，可以分辨早期凋亡和晚期凋亡，我们用的试剂盒是美国的，大概2800元/100份。
1、流式细胞仪（Anexin /PI）双染定量检测凋亡结果，是根据单染还是双染来区分凋亡和死亡细胞的，你凭肉眼观察很难区分的。
2、你的离心时间稍短，通常细胞离心最好是10分钟，特别是凋亡检测，需把所有的细胞及碎片都沉淀下来。
3、流式的细胞不需要调整细胞浓度，机器取样时自动计数。
－－－－－－
1.是的，问题很不标准，我想“为何流式细胞仪检测凋亡细胞效率这么低？” 可能更合适。
2.因为流式相对较为昂贵，我之前用MTT、Hoechst 33342/PI、DNA ladder实验来确定药物浓度、时间曲线，明确凋亡存在，在两次流式结果不理想（凋亡细胞总体比例比较低<1%） 后，曾经怀疑试剂的问题，但是我用流式细胞仪分析凋亡的试剂染了几张片子，感觉还可以（Annexin 绿色荧光/PI红色荧光），凋亡细胞数目绝对不止1%。
3.步骤很简单：
把处理的细胞消化、中和、离心（1100转/min，5min）、PBS 洗2遍，
离心后都是直接倒掉上清的（而不是吸取上清的，会有问题吗？室温而不是在4度，是否会影响？）
２５０ｕｌ结合缓冲液重悬（没有调整细胞浓度？？）， 取100ul加入Annexin 5ul/PI 10ul避光室温15min后加入PBS 400ul 上机。
楼主好强呀！！
检测的时间不是一个固定的参数，需要根据您使用的细胞和目的基因表达情况而定，尤其是对于蛋白（western blot）及功能和表性检测（凋亡，细胞周期等），检测时间受细胞内蛋白质表达量、蛋白质本身的半衰期等因素的影响。
一般地，RT-PCR检测在转染24小时后就可以进行检测（可以延长至48小时进行）；WB检测一般比RT-PCR检测要晚，转染后48～72小时；凋亡和细胞周期属于蛋白功能方面的，一般功能随蛋白表达量的降低而减弱，因此，（在检测出蛋白表达下降后，）可以在48～72小时进行检测。
一般siRNA转染细胞后，基因沉默效果维持3～4天，因此，检测可以在24～72（长至96小时）进行。正如上述，检测时间因不同基因和细胞等因素不同而不同，因此，上述的时间只能提供参考，可能需要选择不同时间点进行优化。
咫尺天涯80008 wrote:
楼主好强呀！！
这是做个笔记，转贴别人的。
TSG101小干扰RNA对SH-SY5Y细胞生长和药物敏感性的作用
Effects of TSG101 siRNA on the growth and drug sensitiity of SH-SY5Y cells
<<中国病理生理杂志 >>2006年09期
刘丽华 , 张宏卫 , 王承忠
目的:探讨TSG101基因对人神经母细胞瘤细胞生长和药物敏感性的调节作用.方法:构建TSG101基因的小干扰RNA载体并将其转导入SH-SY5Y细胞,G418筛选后获得稳定转染的阳性克隆后,应用RT-PCR和Western blotting进行鉴定;MTT法和流式细胞仪检测细胞转染前后生长速度和细胞周期的变化;DNA ladder法和流式细胞仪检测细胞转染前后对顺铂诱导的凋亡的变化;Western blotting检测细胞转染前后凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax,耐药相关蛋白P-gp、MRP的表达变化.结果:成功构建了TSG101的小干扰RNA载体并将其转染SH-SY5Y细胞;筛选到稳定的TSG101低表达的神经母细胞瘤细胞模型;MTT和流式细胞仪检测结果显示,转染TSG101小干扰RNA后的细胞的生长速度显著减慢于对照组(P＜0.05),且G1期的细胞比率显著高于对照组(P＜0.05);DNA ladder法和流式细胞仪检测结果显示,用10 mg/L CDDP处理36 h后,转染TSG101小干扰RNA后的细胞的凋亡数显著多于对照组(P＜0.05),形成DNA条带;Western blotting显示,转染TSG101小干扰RNA后的细胞中Bcl-2和P-gp的表达明显低于对照组.结论:下调TSG101基因能抑制神经母细胞瘤细胞生长,增加细胞对化疗药物的敏感性,提示TSG101在基因治疗中具有较好的临床应用前景.
好深奥啊！
转了—，＋，64，H1，EGFR-Her2，H2+64 6孔，
准备做G418筛选
昨天提蛋白6孔
—，56，64，E-H,H2,H1+64
消化6孔做细胞周期和调亡
空白,-,64,E-H,H1,H1+64
chenpeng599205
稀释传代按1：5~1：10，操作过程大体是这样的：先转染，24~48小时后稀释传代，等细胞贴壁后加入G418即可，然后持续培养，每三天换一次液，同时加G418，直至克隆形成。
关于G418浓度的问题，首先用空白细胞，找出那个使细胞二三天开始死，一周左右死光的浓度，按这个浓度加到转染后的细胞内，不必再提高，这个浓度叫做筛选浓度，通常400~600ug/ml.等挑取了单克隆以后，由于所有的细胞都是稳定转染的细胞了，所以仅用一个维持浓度就可以了，通常 200~400ug/ml，当然你也可以人为地提高一下G418浓度，使筛选条件更加严格。
以上是一点建议，希望对你有帮助。
铺6孔板两个准备做转染后免疫组化和RT。
G418筛选：
浓度500ul/ML，
朱给的浓度：100mg/ml.
－－－－－－－－－－－－－－
转染前各细胞免疫组化结果
HER2 定位于细胞膜：
spc－a－1：+～++
H460：－～＋（部分＋）
A549：＋
l78：—
－－－－－－－－－
EGFR定位于膜和浆
H460：＋＋～＋＋＋
A549：＋＋～＋＋＋
spc－a－1：＋＋～＋＋＋
l78：＋＋
G418筛选换液，2ml培养基＋10ul G418(100mg/ml)
转染准备明天做RTPCR和免疫组化
MTT检测细胞生长
1．取96孔细胞培养板，每孔中加0.1ml含2×104～10×104靶细胞的培养液（含10％小牛血清的RPMI-1640培养液），在37℃ 5％ CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养2～3小时让细胞帖壁（如果是悬浮细胞可直接进行下一步）
2．用RPMI-1640培养液2～10倍递次稀释细胞因子标准品，根据情况2～5倍递次稀释待检样品，每孔加0.1ml稀释的标准品和待检样品，每个稀释度3个重复孔。对照孔6个：3个阳性对照孔，每孔加0.1ml含大剂量细胞因子的RPMI-1640培养液，3个阴性对照孔，每孔加0.1ml RPMI-1640培养液。在37℃ 5％ CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24～48小时或预定的时间。
3．吸去培养液，用PBS洗涤一次（如为悬浮细胞，应在吸去上清液前离心培养板）。
4．每孔加0.1ml PBS和10μl MTT染液，在37℃ 5％ CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4～6小时。
5．每孔加0.1ml酸化异丙醇，也可用含10％ SDS的10mmol/L HCl代替酸化异丙醇，在振荡器上振荡混匀，让还原产物充分溶解。置酶联检测仪上测定光密度（OD）值，检测波长570nm，参考波长630nm。以OD值对样品稀释度作图，比较标准曲线和待测样品曲线即可求得待测样品中细胞因子的含量。
EGFR muations in China
吴一龙
李龙芸
周彩存 （ 肿瘤 2006，25（5）：458）
姜斌 （上海第二医科大学学报 2005，25（11）：1148）
张力
刘伟
潘振奎 （癌症 2005，24（8）：919）
广州中科院
浙江
－－－－－－－－－－
程刚：手术是唯一的差异因素？
昨晚铺板细胞PBS冲洗，换无血清无抗生素培养基，今晚转染周5做双染色。
质粒测浓度。
G418加药：pbs冲洗，加2ml培养基，加10ul G418(100mg/ml)，第三天（500ul/ML）
6孔转染后24小时做免疫组化。
6孔转染后40小时做RT。
晚上转染。
蛋白浓度测定
所需物品及试剂：微孔板、PBS、牛血清白蛋白（蛋白标准品）、考马斯亮蓝。
实验步骤：
1、第一列孔板依次加入如下量的PBS（单位ul）：
15、14、13、12、11、10、9、8
2、然后在上述孔中依次加入牛血清白蛋白单位（ul）：
0、1、2、3、4、5、6、7
3、待测蛋白孔中每孔加入14ul的PBS，然后每孔加入1ul样品（记住加样顺序）。
4、所有孔中（标准曲线组和待测样品组）加入285ul考马斯亮蓝。
5、摇匀，上机以波长595读数，以第一列数据及加入标准品浓度制作标准曲线。由曲线产生方程，根据该方程计算待测蛋白质浓度。
2007/03/08
PCR/RT-PCR疑难问题解答
一、问题：RT-PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。
可能原因：
1．RNA被降解
建议解决方法：
在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA；
在将组织从动物体取出后立刻处理在100％甲酰胺中储存RNA；
如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。
2．RNA中包含逆转录抑制剂
建议解决方法：
通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（/）乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元（0.25μg到0.4μg/μl）以帮助小量样品RNA的恢复。
逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，spermidine，甲酰胺和胍盐。
将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。
3．多糖同RNA共沉淀
建议解决方法：
使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。
4．用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火
建议解决方法：
确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。
对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT)或随机六聚体.
确定GSP是反义序列。
5．起始RNA量不够
建议解决方法：
增加RNA量。
对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。
6．RNA模板二级结构太多
建议解决方法：
将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火.
提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃，对ThermoScript可以到65℃。
注意：不要在＞60℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP。对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反应温度≤65℃。
注意：不要在高于37℃时使用M-ML。
如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。
7．引物或模板对残余的RNA模板敏感
建议解决方法：
在PCR前用RNaseH处理。
8．靶序列在分析的组织中不表达
建议解决方法：
尝试其他靶序列或组织
9．PCR没有起作用
建议解决方法：
对两步法RT-PCR，不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物。
二、问题：PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。
可能原因：
1．PCR引物设计较差
建议解决方法：
避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。
2．DNA含有抑制剂
建议解决方法：
诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNA。
3．富含GC的模板
建议解决方法：
对于GC含量＞50％的模板，使用PCRx Enhancer Solution。
4．模板浓度太低
建议解决方法：
使用104拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号。
5．镁离子浓度太低
建议解决方法：
从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意：对实时定量PCR，使用3mM到5mM的镁离子浓度。
6．退火温度太高
建议解决方法：
使用表4的公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。
7．引物浓度太低
建议解决方法：
最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。
http://www.bioon.com/experiment/pcr5/86244.shtml
http://www.biox.cn/content/20050426/12406.htm
BRK100T2005.pdf (188.47k)
[1] 前言
将逆转录 (Reerse Transcription；RT)反应和 PCR (Polymerase Chain
Reaction) 反应组合在一起的 RT-PCR法，是能够比较简便和迅速地检测来自多个
样品的RNA的检测方法，所以，近年来被广泛用作mRNA 表达有无、表达量、长度
的异常等 RNA的分析和cDNA克隆。
本公司使用基因工程学的方法改变了来自 MML (Molony murine leukemia
irus) 的逆转录酶，使阻碍合成长链 cDNA 的 RNase H失活，并进一步开发成功
了大幅度提高 cDNA合成能力的改良型酶 ReerTra AceTM 。本产品是充分发挥
ReerTra AceTM 的优良的 cDNA 合成能力的 First strand cDNA 合成试剂盒及
RT-PCR试剂盒。
ReerTra Ace -α-TM 是利用ReerTra AceTM 的 First strand cDNA 合成试剂
盒。具备了RT用引物及Positie Control，所以能够简单地进行逆转录反应。可以应
用于通过手上的各种DNA聚合酶的PCR 反应模板的制备。例如，通过和High fidelity
PCR 用酶，long PCR 用酶等的结合，能够进行更加符合目的的 RT-PCR 。
ReerTra DashTM 是将ReerTra AceTM 和具有优良扩增效率及反应速度的
DNA 聚合酶的 KOD Dash ®结合，具有高敏感度的 RT-PCR试剂盒。可以将RT 反
应和PCR 反应在同一试管中进行。能够高效简便地进行RNA的分析和cDNA克隆。
PCR-4.rar (295.48k)
G418第5天，600ug/ML
流式细胞仪测调亡，细胞周期双染色。
明天取细胞免疫组化结果。
哇，jingdao feiqi
用小双链RNA抑制转化入HUEC中绿色荧光蛋白基因的表达
单志新 林秋雄 余细勇 邓春玉 郑猛 谭虹虹 符永恒 杨敏 林曙光
摘 要：目的:建立稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的人脐静脉血管内皮细胞(HUECs),研究小干扰RNA(siR-NA)对HUECs中GFP表达的抑制作用.方法:用lipofectamine2000将编码GFP的质粒pN3-EGFP转入HUECs中.用G418筛选并维持已转化pN3-EGFP的HUEC(HUEC-GFP).利用T7RNA转录试剂盒,制备可抑制GFP基因表达的siRNA(GFPsiRNA)和无关对照的RNA(control siRNA).用oligofectamine将siRNA转入HUEC-GFP中.继续培养48 h后,检测HUEC-GFP中GFP蛋白和mRNA表达水平.结果:用G418筛选获得了HUEC-GFP细胞株,可以观察到GFP的稳定表达.HUEC-GFP转化siRNA后48 h,GFP的荧光强度明显下降,而对照组的荧光强度无明显下降.半定量RT-PCR检测显示,GFPsiRNA对GFP mRNA表达有较强的抑制作用,抑制率达40%,而control siRNA对GFPmuRNA表达水平无明显的抑制作用.结论:利用体外转录合成的siRNA能有效地抑制HUECs中GFP的表达.
关键词：RNA干扰;绿色荧光蛋白;人脐静脉血管内皮细胞;脂质体
分类号：Q78 文献标识码：A
文章编号：1000-4718(2006)02-0262-04
siRNA suppresses the green fluorescent protein (GFP) gene expression in human umbilical ein endothelial cells
SHAN Zhi-xin LIN Qiu-xiong YU Xi-yong DENG Chun-yu ZHENG Meng TAN Hong-hong FU Yong-heng YANG Min LIN Shu-guang
基金项目：国家自然科学基金项目(No.30300421;No.30271287);广东省自然科学基金团队项目(No.015015);广东省自然科学基金团队项目(No.033189)
作者简介：余细勇,通讯作者Tel:020-83827812-41209;E-mail:yuxycn@hotmail.com
作者单位：单志新（广东省人民医院医学研究中心,广东,广州,510080）
林秋雄（广东省人民医院医学研究中心,广东,广州,510080）
余细勇（广东省人民医院医学研究中心,广东,广州,510080）
邓春玉（广东省人民医院医学研究中心,广东,广州,510080）
郑猛（广东省人民医院医学研究中心,广东,广州,510080）
谭虹虹（广东省人民医院医学研究中心,广东,广州,510080）
符永恒（广东省人民医院医学研究中心,广东,广州,510080）
杨敏（广东省人民医院医学研究中心,广东,广州,510080）
林曙光（广东省人民医院医学研究中心,广东,广州,510080）
参考文献：
[1]Fire A,Xu S,Montgomery MK,et al.Potent and specific genetic interference by double- stranded RNA in caenorhabditis elegans[J].Nature,1998,391(6669):806-811.
[2]Brummelkamp TR,Bernards R,Agami R.A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells[J].Science,2002,296(5567):550-553.
[3]Sui GC,Soohoo C,Affar EB,et al.A DNA ector- based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99:5515-5520.
肺腺癌患者酪氨酸激酶信号传导通路的异常与临床预后
吴一龙 林嘉颖 杨学宁 乔贵宾 王坤 陈刚
作者单位：510080 广州，广东省肺癌研究所 广东省人民医院肿瘤中心
【摘要】 目的 探讨肺腺癌患者酪氨酸激酶传导通路的异常和临床预后的关系。方法抽提10例肺腺癌标本及其癌旁组织的总RNA，标记荧光，与含13 824个基因的基因芯片进行杂交，经洗片、扫描，计算机分析比较两种组织的差异表达基因。每次实验重复2次，结果取平均值。采用聚类分析和判别分析对海量数据进行数据挖掘，得出结果后再与临床预后因素结合分析。结果 根据酪氨酸激酶传导通路上的差异，10例标本聚类为3类，海量基因聚为5类。不同预后的标本有不同的特征基因群，预后最好的一组患者高表达抗增殖和免疫相关基因；预后最差的患者在高表达与增殖相关基因的同时，抗增殖和免疫防御相关基因处于低表达水平。结论 肺腺癌的酪氨酸激酶传导通路异常主要表现为3种类型，由此决定了肺腺癌不同的生物学行为和不同的预后。
【关键词】 肺肿瘤； 信号传递； 基因表达； 酪氨酸
许多研究表明，酪氨酸激酶传导通路是促进细胞增殖的主要信号通路，与肺癌的发生发展密切相关，但迄今为止，它是如何参与肺癌细胞的形成、增殖、浸润及转移，从而影响肺癌的预后，尚未完全清楚。这是因为酪氨酸激酶传导通路是一个非常复杂的调控网络，涉及多个基因群的相互作用。既往对其研究多从单个基因或单个蛋白着手，结果往往是挂一漏万，难窥全貌，互相矛盾的结果为多，研究多数停留在浅层次水平。基因芯片的出现为高通量分析各种信号分子提供了强有力的工具。本课题利用20张含13 824个基因的基因芯片检测了10例肺腺癌标本与癌旁组织基因表达谱的变化，把海量的基因信息与详细的临床资料相结合，探讨了酪氨酸激酶传导通路的异常和临床预后的关系。
材料与方法
一、材料
1.标本采集：试验所需的10例经组织病理学证实的肺腺癌标本及其癌旁组织来自广东省肺癌研究所组织库，所有组织均为即刻液氮保存。患者的临床及随访资料来自相关的临床数据库。
2.基因芯片选择：基因芯片由上海生物芯片国家工程研究中心提供。芯片上点有13 824个人类基因和EST片段，以及768个对照。包括细胞分化、信号传导、细胞结构、免疫、代谢等相关基因。
二、方法
1.总RNA提取：肺腺癌及其癌旁组织的总RNA抽提采用Trizol试剂法。分光光度计测浓度和纯度，总RNA质量用1 % 琼脂糖电泳检测，再用灵敏度更高的Agilent 2100分析仪验证。
2.荧光探针制备、纯化与杂交:将肺腺癌组织作为实验组，所有癌旁组织混合作为共同的对照组。采取反转录cDNA第一链标记，以cy3标记癌组织（呈绿色），cy5标记癌旁组织（呈红色），荧光探针的纯化采用QIAquick@Spin column Kit。取等量的癌组织探针与癌旁组织探针混合后与基因芯片在42℃杂交箱中避光杂交16～18 h，每例癌组织与癌旁组织的芯片杂交重复2次，共进行20次杂交。
结果判断：红、绿荧光信号的差异反映该基因在癌组织和癌旁组织中表达水平的差异。绿色代表上调，红色代表下调，黄色代表表达无差异（图1）。
图1 基因芯片杂交图（局部）
3.图像扫描及结果分析：经严格洗片后，用Agilent扫描仪扫描芯片。图像分析软件采用ImaGene软件，将扫描得到的图像定量转化为数值。数据进一步导入生物信息学分析软件Genespring，进行标准化并计算ratio值（两种荧光cy3与cy5的比值）。大于阴性对照 ±2s的点为阳性点。ratio值在0.5～2.0范围内的基因不存在表达差异，>2为该基因表达上调，<0.5为该基因表达下调。采用聚类分析和判别分析对海量数据进行数据挖掘，得出结果后再与临床预后因素结合分析。
结 果
一、临床特征
10例入选病例均为完全性手术切除并经组织病理学确认的肺腺癌患者。其中男6例，女4例，年龄46～65岁，平均年龄55.5岁。所有患者术前未经抗肿瘤治疗，ⅢA期患者则行术后辅助化疗和/或放疗。随访至2003年5月，随访时间9～55个月，中位随访时间27.9个月。主要临床特征见表1。
表1 10例肺腺癌患者的临床特征
标本号
性别
T
N
M
分期
生存期(月)
L1
男
3
0
0
ⅡB
55+
L2
男
2
0
0
ⅠB
46+
L3
男
3
0
0
ⅡB
45+
L4
女
2
0
0
ⅠB
45
L5
女
3
1
0
ⅢA
17
L6
男
2
2
0
ⅢA
14
L7
男
3
2
0
ⅢA
14
L8
女
3
1
0
ⅢA
17
L9
女
2
2
0
ⅢA
17
L10
男
3
2
0
ⅢA
9
注：+代表L1、L2、L3至今仍生存无复发转移，其余患者均死于远处转移
二、总RNA质量鉴定
总RNA的A260/A280均在1.8～2.0之间, 28S与18S电泳条带清晰，28S条带约为18S条带的2倍。
三、聚类分析结果
1.K-MEANS标本聚类：设定分类数为3，10例标本聚类结果见表2：L1、L2、L3、L4聚为一类，为Ⅰ、Ⅱ期患者，生存期大于45个月。L5、L6、L7、L8、L9聚为第二类，为ⅢA期患者，生存期为14～17个月。L10为第三类，也为ⅢA期患者，但生存期只有9个月。秩和检验结果显示，不同的3类标本在分
表2 10例标本的K-MEANS聚类
标本号
标本聚类
距离
L1
第1类
8.274
L2
第1类
9.220
L3
第1类
8.028
L4
第1类
9.274
L5
第2类
7.804
L6
第2类
7.472
L7
第2类
10.352
L8
第2类
9.066
L9
第2类
7.822
L10
第3类
0.000
表3 5类基因在不同标本中的平均表达水平（ratio值）
组别
L1
L2
L3
L4
L5
L6
L7
L8
L9
L10
第1类基因
0.960
0.480
3.359
1.739
0.562
1.060
2.623
1.273
0.651
7.679
第2类基因
0.949
0.500
0.641
10.653
0.608
0.792
0.446
0.602
1.130
0.831
第3类基因
3.992
4.453
2.969
2.953
2.925
1.961
2.096
2.598
2.623
1.247
第4类基因
0.834
0.759
0.847
0.745
0.859
0.860
0.912
0.813
0.812
1.146
第5类基因
1.518
1.955
1.378
1.602
2.666
2.211
2.484
2.354
2.207
1.581
期（P=0.015）和生存期(P=0.022)上差异有显著意义。
2.K-MEANS基因聚类：设定分类数为5，海量基因聚类为5类基因，它们在不同标本中的平均表达水平见表3：第2、4类基因在各标本中的表达基本在0.5～2.0范围内，差异无显著意义;第1、3、5类基因在部分标本中表现为上调，且在不同聚类标本中的表达水平不一。第1类基因包含两个基因，分别是类血小板源性生长因子受体（PDGFRL）和类原癌基因SKI（SKIL）。它们在预后最差的第3类标本（L10）中表达最高；第3类基因包含9个基因，如细胞因子诱导的激酶（CNK）、B 淋巴细胞酪氨酸激酶（BLK）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体2α（CSF2RA）等。这些基因多参与免疫防御和抵抗细胞增殖的信号传导。它们在预后最好的第1类标本（L1、L2、L3、L4）中表达最高，在第2类标本（L5、L6、L7、L8、L9）中次之，在第3类标本（L10）中表达最低；第5类基因有23个基因，如肝细胞癌源性生长因子（HDGF）、有丝分裂原激活蛋白激酶激酶（MAPKAPK2）、原癌基因cmer 编码的酪氨酸激酶（EphB4）等。这些基因多参与细胞的增殖调控。它们在第2类标本（L5、L6、L7、L8、L9）中表达最高，而在其他标本中表达差异无显著意义。第1、3、5类基因在各标本中的表达情况见图2，各类基因所包含的基因群及其表达水平见表4～6。
图2 第1、3、5类基因在各标本中的表达情况
表4 第1类基因在L10中的表达（ratio值）
序号
基因名
L10
1
类血小板源性生长因子受体(PDGFRL)
10.842
2
类原癌基因SKI(SKIL)
4.516
表5 第3类基因在L1、L2、L3、L4中的表达（ratio值）
序号
基因名
L1
L2
L3
L4
1
细胞因子诱导的激酶(CNK)
2.811
4.326
2.078
2.373
2
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体2α（CSF2RA）
2.943
4.932
2.383
4.925
3
原癌基因ERBB3
1.833
3.735
3.401
3.261
4
抑癌基因(AIP-1)
3.564
3.248
1.998
1.973
5
B淋巴细胞酪氨酸激酶(BLK)
3.141
4.195
1.409
2.309
6
RAS癌基因家族相关基因(SEC4L)
4.906
2.561
3.106
1.261
7
受体型酪氨酸磷酸酶F(PTPRF)
2.114
7.137
5.867
3.916
8
蛋白磷酸酶2(PPP2RI
4.586
6.476
1.778
2.190
9
转录因子AP-2(TFAP2C)
8.196
5.294
3.882
4.431
四、判别分析结果
以第1、3、5类基因作为判别标准，进一步作判别分析，按照这三类基因的表达情况，对标本进行判别分类。观察它们能否把原来三类标本很好的区分开来。结果显示：判别分类与原分类符合率为100%，说明这三类基因对标本的判别效果很好。标本判别分类图见图3。
图3 标本差别分类图
表6 第5类基因在L5 、L6 、L7 、L8、L9中的表达（ratio值）
序号
基因名
L5
L6
L7
L8
L9
1
成纤维生长因子9（FCF9）
4.000
2.887
1.735
1.688
2.336
2
肝细胞癌源性生长因子(HDGF)
2.290
2.302
1.617
2.354
1.790
3
干扰素-α诱导跨膜蛋白(IFTTM1)
2.739
2.010
5.205
2.503
1.151
4
干扰素-α诱导蛋白27(IFI27)
2.68
1.048
3.662
2.517
1.683
5
干扰素诱导的鸟苷酸结合蛋白2(GBP2)
2.571
2.447
0.737
2.966
1.599
6
干扰素-α诱导蛋白(G1P3)
3.127
0.941
8.775
5.049
1.510
7
集落刺激因子受体1(CSF1R)
6.239
3.929
1.696
4.38
2.663
8
原癌基因c-mer编码的酪氨酸激酶(Ephb4)
2.761
5.566
2.172
1.564
4.366
9
酪氨酸激酶(MERTK)
2.175
2.347
1.638
2.976
1.220
10
酪氨酸激酶2(TYK2)
1.839
2.048
2.521
2.173
2.043
11
信号转导子和转录激动子1(STAT1)
1.536
2.271
2.92
1.826
0.823
12
信号转导子和转录激动子2(STAT2)
2.394
2.753
2.314
2.799
1.378
13
STAM
5.722
4.033
4.764
1.391
3.980
14
有丝分裂原激活蛋白激酶激酶(MAPKAPK2)
3.503
2.406
1.173
2.165
4.527
15
磷脂酶A2(PLA2G2A)
1.911
4.067
1.711
3.311
2.644
16
磷脂酶C(PLCB3)
3.573
2.585
1.802
0.120
3.029
17
多肽激酶MYLK
2.303
2.947
3.472
0.936
1.770
18
RAS蛋白激活分子(GRB2)
3.659
2.231
0.954
3.125
1.655
19
SHCI（含癌基因Scr同源区）
3.391
2.906
4.539
2.669
2.909
20
受体型酪氨酸磷酸酶(PTPA2)
2.014
1.496
1.319
2.984
2.012
21
蛋白磷脂酶（PPP2R4）
3.942
2.086
2.098
1.785
1.510
22
myb1相关蛋白(TOM1)
3.860
2.645
2.808
1.297
2.116
23
癌基因-akt编码蛋白(AKT1)
2.752
2.262
2.98
1.983
4.299
讨 论
酪氨酸激酶信号传导通路是细胞信号传导网络中最重要的传导通路之一，几乎所有的生长因子刺激细胞增殖的信号，以及大部分细胞因子的信号、抗原结合淋巴细胞表面受体诱发细胞各种反应，都离不开酪氨酸激酶传导通路［1］。
在本研究中，我们尝试探讨肺腺癌酪氨酸激酶传导通路复杂系统的异常与临床预后的关系。
在单独对10例标本进行K-MEANS法聚类分析后，我们惊奇地发现，聚类结果与临床预后非常吻合。L1、L2、L3、L4归为一类，这一类为Ⅰ、Ⅱ期的患者，生存期均大于45个月，其中L1、L2、L3至今仍存活无复发转移。L5、L6、L7、L8、L9归为第二类，这一类为ⅢA期患者，平均生存期为15.8个月。他们均在1年左右死于转移。L10为第三类，也是ⅢA期患者，生存期只有9个月。非参数检验结果显示，各类标本在分期（P=0.015）和生存期(P=0.022)上差异有显著意义。
我们进一步寻找同一类标本的共性及不同标本间的特性所在，探讨这些特征能否解释它们不同的生物学行为。
对酪氨酸激酶信号传导通路上所有基因进行了基因聚类。基因被分成5大类。各类基因在不同标本聚类中的表达有一定的规律，明显与预后相关。
L1、L2、L3、L4是预后最好的一组患者，它们的共同特点是高表达参与免疫防御和抵抗细胞增殖的信号传导的第三类基因，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体、 B 淋巴细胞酪氨酸激酶（BLK）、受体型酪氨酸磷酸酶F（PTPRF）和蛋白磷酸酶2（PPP2R1B）等［2］。它们的高表达一方面促进了机体的免疫功能，另一方面又可使酪氨酸激酶去磷酸化而失活，阻断生长信号的下传，因而在一定程度上阻止了这组患者肿瘤的恶性转化。但这组患者也高表达与增殖相关的表皮生长因子受体和转录因子AP-2，所以也表现为细胞无限增殖的特点［3］。只是众多抑制因素阻止了它的进一步恶化。从而相对不易发生侵袭和转移。根据第三类基因的表达情况可把这一组患者从其他患者中区分开来。
L5、L6、L7、L8、L9是预后较差的一组患者，均为ⅢA期，平均生存期为15.8个月。他们均在1年左右死于转移。这组患者的共同特点是高表达第五类基因，这些基因多参与细胞的增殖调控。它们的高表达促进了细胞的增殖，抑制了细胞的凋亡，因而一定程度上推动了细胞的恶性转化。另一方面在这一类基因中也高表达某些与免疫相关的第三类基因，但表达水平低于第一组患者，增殖基因群优势表达与免疫基因群弱势表达使这组患者表现为细胞恶性程度较高，易发生侵袭和转移，但预后还不至于最差。这类基因的高表达同样可把这一组患者与其他患者区分开来。
L10是预后最差的患者，生存期只有9个月，它的特点是高表达与细胞增殖相关的第一类基因和某些第五类基因，而与免疫防御和抵抗细胞增殖相关的第三类基因并没有相应的激活，说明L10的免疫功能处于相对抑制状态而增殖高度活跃，这是其高度恶性的生物学基础。
为了验证海量基因信息聚类的正确性，我们把没有差异表达的第二、四类基因去除，仅利用第一、三、五类基因进一步作了判别分析，以探讨这三类基因能否把三类标本很好的区分开来。结果显示这三类基因可把三类标本很好的区分开来，正确率达100%。可以说，三类基因的不同表达是这三类标本的主要特征之一，说明了在酪氨酸激酶传导通路上，不同基因的异常激活了不同的信号传导，从而赋予肺腺癌细胞不同的特性，形成不同的生物学行为。
综上所述，酪氨酸激酶传导通路上的基因表达谱可以在一定程度上反映肿瘤细胞增殖趋势、转移潜能及免疫能力，不同类别的标本有不同的基因分布，涉及大量不同功能的基因群以及这些基因群功能的优势平衡问题，这是一个相当复杂的系统，决不是研究其中一两个基因就能解决的，因此，应将肺腺癌看成一个复杂系统，采用新的研究思路和新的生物信息学方法，才有可能预测其临床表现和临床预后，并为进一步研究提供线索和方法学［4］。本研究提示，肺腺癌的酪氨酸激酶传导通路异常主要表现为3种类型，由此决定了肺腺癌不同的生物学行为和不同的预后。
参考文献
1 Xu NZ. Signal transduction and tumor. In: Zeng YX,eds. Oncology.2nd ed. Beijing: People′s medical Publishing House ,2003.128-150.
徐宁志. 信号传导与肿瘤.见：曾益新，主编. 肿瘤学.第2版. 北京：人民卫生出版社，2003.128-150.
2 Lilly MB, Zemskoa M, Frankel AE, et al. Distinct domains of the human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor subunit mediate actiation of Jak/Stat signaling and differentiation. Blood, 2001, 97: 1662-1670.
3 Zhu CH, Domann FE. Dominant negatie interference of transcription factor AP-2 causes inhibition of ErbB-3 expression and suppresses malignant cell growth. Breast Cancer Res Treat, 2002, 71: 47-57.
4 Weng G, Bhalla US, Iyengar R. Complexity in biological signaling systems. Science， 1999, 284:92-96.
WB
Maker，56，64＋H1，E-H，H2，64，－，＋
-------------------一抗效价------------------二抗效价--------------------二抗类型
actin
GAPDH
EGFR
HER2
akt
p－akt
p－EGFR
http://www.cellsignal.com/products/9926.html
MAPK Family Antibody Sampler Kit #9926
Kit Includes Quantity Applications Reactiity MW (kDa) Source
p44/42 MAP Kinase Antibody # 9102 40 microliters W IHC-P IF-IC F H M R Mk Hm B Z 42, 44 Rabbit
SAPK/JNK (56G8) Rabbit mAb # 9258 40 microliters W H M R Mk Mi Hm 46, 54 Rabbit
p38 MAP Kinase Antibody # 9212 40 microliters W IP IHC-P IF-IC F H M R 43 Rabbit
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody # 7074 50 microliters Goat
http://www.dxy.cn/bbs/post/iew?bid=38&id=1045210&sty=3&keywords=HER2+%BF%B9%CC%E5+blot
HER2
G418筛选失败
未转进去的克隆占优势，转染克隆劣势。
RT-PCR荧光定量，下周一配胶再做半定量
WB
M，+,-,56，64，EH,64＋H1,H2, 乳腺10ug，乳腺20ug
EGF刺激10ng/ML后提蛋白
+-,56,64,H1,E-H,56+H2
明天显影，乙醇固定准备周一做流式。
G418筛选失败的细胞准备提蛋白
http://www.cellsignal.com/products/9910.html
9910
RT-PCR
EH,-,67,64,64h2,h1
Maker，空，—，56，64，H2,64＋H1，(EH，56，H1)
http://www.transhold.org/wiki/%E9%A6%96%E9%A1%B5
PCR
俺准备明天一早铺六孔板，下午或者晚上转染。但是由于转入的蛋白是促细胞凋亡的，预计分别在24，36小时收细胞用流式通过细胞周期的亚二倍体峰和Annexin -PI测凋亡。可是好像刚好在周末，想请教一下版主：Annexin -PI测凋亡是否与测细胞周期的细胞样本制备方法相似，细胞可以固定到下周一吗？
另外，由于六孔板转染所需的脂质体和质粒均较多（资金有限!!$),用12孔板培养细胞做流式如何？版主可否给点建议？
问题有点多，谢了！:
机器及试剂：
流式细胞仪是美国BECKMAN-COULTER(贝克曼-库尔特)公司生产。
机器型号：ELITE. 激光波长488nm，功率15 mW
取106 已固定的细胞，用PBS洗两遍，去上清后加入300μl DNA染液(内含碘化丙啶100μg/ml和RNA酶20单位/ml)，室温30分钟。
上机：激光管预热30分钟后用荧光微球(美国BECKMAN-COULTER公司)调整仪器，使各放大器接收的信号的HC值<2%，收集12000个细胞，DNA周期分析用美国PHEONIX公司的MULTYCYCLE软件，最后计算出细胞各期的百分数。另外，细胞凋亡是用仪器自带软件处理，直接得出细胞的凋亡率。
古城快刀 wrote:
俺准备明天一早铺六孔板，下午或者晚上转染。但是由于转入的蛋白是促细胞凋亡的，预计分别在24，36小时收细胞用流式通过细胞周期的亚二倍体峰和Annexin -PI测凋亡。可是好像刚好在周末，想请教一下版主：Annexin -PI测凋亡是否与测细胞周期的细胞样本制备方法相似，细胞可以固定到下周一吗？
另外，由于六孔板转染所需的脂质体和质粒均较多（资金有限!!$),用12孔板培养细胞做流式如何？版主可否给点建议？
问题有点多，谢了！:
Annexin -PI测凋亡用活细胞
用6孔板
K,+-,56,64,h1,EH,56H2, 56,H2
K,+-,56,64,h1,EH,56H2, 64,56H1
http://basicmed.sysu.edu.cn/ReadNews.asp?NewsID=1934
东 说:
http://ecampus.sysu.edu.cn
1，2，3，4，5，6，7，8，9，10
mock－control－56—64－67－H1+2－H3+4－EH－56H1+2－64H3+4
1.mock
2.control
3.EGFR-218-1
4.HER2-216-2
5.EGFR-219-1和HER2-217-2
6.EGFR-218-1和HER2-216-2
7.EH双
8.56
9.67
10.H1
11.mock
12.mock
123456789(67)
E_EGFR （兔北京博士得）
BJ_akt（兔）,pJnk（兔）
A_GAPDH（鼠）,actin（鼠）
---------------------------
1234567810(H1)
PEH_pEGFR1068（鼠）,HER2（兔北京中杉金桥）
PA_pAKT473（鼠）
GE_GAPDH（鼠）,ERK（兔）
EGFR: 175KDa 博士德 兔
pakt：60KDa 兔
http://www.cellsignal.com/products/4056.html
GAPDH:36 鼠
------------------------------------
HER2 185KDa 中山 兔
akt：60KDa 兔 Akt Antibody #9272
http://www.cellsignal.com/products/9272.html
GAPDH:36 鼠
－－－－－－－－－－－－
1－2－3－4－5－6－8－9－10
dsRNAs在哺乳动物细胞内可以活化两条途径，超过 30bp 的 dsRNAs引起广泛的非特异性 mRNA 的降解和翻译的关闭；体外合成的短的 19－23bp 的dsRNAs 分子模拟 RNAi 途径中间体，引起序列特异性的基因表达抑制。
RNAi研究的范畴
自从Tuschl发现哺乳动物存在RNAi机制后，RNAi方面的研究热潮一浪高过一浪。有关研究主要集中在几个方面：①继续利用低等动物来研究参与RNAi过程中的主要蛋白质和酶；②研究RNAi如何调控基因的表达；③利用RNAi技术进行基因鉴定和发育和基因组研究，如构建基因敲减动物模型；④利用RNAi来治疗疾病。
绿色荧光蛋白（GFP）是分离自水母 Aequorea ictoria(A) ，分子量为 27kDa
的胞浆蛋白。由于 GFP 在细胞中表达后呈易于观察的绿色荧光，因此常用于鉴定基因表达的报告基因。
EGFR在调节细胞生长和组织修复中起十分重要作用，其信号系统所引起的细胞效应包括细胞增殖、迁移、粘附等多个环节，并借助一种内吞依赖的副调节机制防止过多的信号传导。虽然EGFR通路传导的阻断可加速悬浮正常上皮细胞的凋亡，但在正常或器官培养的条件下，由于胞间通讯及细胞与胞外基质间信号传导的存在，使EGFR阻断对正常细胞的存活以及功能没有明显的影响。EGFR几乎表达于血细胞外所有的组织与细胞，但目前正在进行的以EGFR为靶标的单克隆抗体治疗或小分子阻断治疗等仅见到轻微的皮疹、腹泻等副反应。
最初提示EGFR癌基因的证据源于发现EGFR基因与鸟类成红细胞白血病病毒致癌基因同源。人类的多种肿瘤包括上呼吸道、上消化道、结肠、胰腺、乳腺、卵巢、膀胱、肾脏和脑胶质瘤中都能检测到EGFR的异常RNA转录与蛋白表达过度，提示EGFR在肿瘤细胞发生发展中的作用。与正常细胞相比，肿瘤细胞特别是EGFR表达阳性肿瘤细胞的生长、进展明显依赖于EGFR信号转导，且有显著的降调机制缺陷。以外，由于肿瘤包块往往缺乏正常的组织结构，肿瘤细胞难以从胞间通讯以及细胞与胞外基质间信号传导信号，常依赖EGFR介导的MAPK、AKT以及STAT3下游通路提供生存信号，肿瘤也因此而更依赖于EGFR。
机体发生肿瘤时往往EGFR过表达，EGFR的高表达促进肿瘤细胞增殖、血管生成、粘附、侵袭和转移，抑制肿瘤细胞的凋亡。EGFR的致癌活性是EGFR基因突变、基因过度表达和基因重排的结果。
学习 学学
用RNAi技术治病不再纸上谈兵
——访2006年度诺贝尔生理学或医学奖获奖者Mello教授
本报记者 林建宏
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2006年10月12日,本报对2006年度诺贝尔生理学或医学奖的获奖者国斯坦福大学的Andrew Z. Fire教授和美国马萨诸塞州立大学的Craig C. Mello教授及他们具有划时代意义的发现——RNA干扰(RNA inference,RNAi)进行了详细报道。RNAi这种机制广泛存在于生物体中,其以独特的方式对基因表达进行调节,且其实现调节作用的载体小干扰RNA(siRNA)结构简单、易于人工合成。因此,RNAi技术是人工关闭特定基因表达的有力工具,该技术很可能成为开启基因治疗新纪元的一把钥匙。2007年3月26日,本报记者有幸在北京对前来与清华大学和中国科学院进行学术交流的Craig C. Mello教授进行了独家专访,请他就RNAi技术在未来的应用等问题谈了自己的看法。
论坛报:在去年RNAi技术因您和Fire教授获诺贝尔奖而被世界认可时,很多人尚在猜测,小小的RNA真的能够治疗现在诸多药物都难以治愈的疾病吗?2006年发表的一项Ⅱ期临床研究结果显示,一种以RNAi技术为核心的药物——beasiranib在被注射入湿性老年黄斑变性(wet AMD)患者的眼球后,可使眼底部血管内皮生长因子(EGF)保持“沉默”,从而阻止病情的发展。这意味着,以RNAi为基础的药物开始正式进入临床,您对此怎么看?
Mello教授:目前从这项研究结果看,以RNAi机制为基础的治疗方法疗效很好,我想RNAi技术会得到更多的应用,还将会有更多以RNAi机制为基础的药物被用于临床。对于医学领域而言,RNAi机制的应用领域有两种:一是用于实验室中基因功能的研究,作为实验室的一种诱发基因沉默的工具,RNAi可诱发实验室中培养细胞特定基因的沉默,也可用来使胚胎细胞中的一些基因沉默,以“敲除”这些基因的功能,这可使研究者更好地理解基因表达调控通路,从而有利于开发RNAi药物和传统药物,这种方法也是现阶段RNAi技术在医学领域的主要应用。第二种则是真正意义上的“RNA药物”,这种药物以RNAi技术为原理,借助更加先进的技术,使其能够在人体不同组织器官中发挥作用。这类药物刚刚进入Ⅰ期临床,beasiranib这个药是直接被注射入眼球而发挥作用的,将来研发出来的RNAi药物可能只需要直接注射进入血管便可被运输到需要治疗的组织或器官当中。当然,开发这类RNAi药物需要花费几年甚至更长的时间,开发这类药物载体的难度也会更大。
论坛报:基因组的测序工作已经完成数年了,现在人们已知,在人体内存在大量重复序列,而引发RNAi的主要物质——siRNA的长度仅有18~22个核苷酸,如何能够用这么短的核苷酸序列在体内识别特异性基因位点的时候不会发生错配呢?
Mello教授:21个核苷酸对于特异性地识别人体任何单个基因已经足够了。siRNA确实非常小,但它蕴含着大量信息。它可与靶基因特异性地结合,进而使特定基因功能沉默,所以当开发这类药物的时候,要格外注意避免产生任何不需要的不良反应,当然对于任何药物而言都是这样。通常我们在实验室中可以在对其他基因影响非常小的情况下成功使一特定基因沉默,所以对于我们而言,保证特异性的作用不是很困难。
论坛报:我国近年来基础医学及临床医学领域的发展为世人所共睹,但我国医学领域科研工作的重点多放在解决具体的疾病方面,比如研究肿瘤的表型或分析遗传病的常见突变位点等等,而诸多国外科学家却把研究的重点放在模式动物方面,比如您选择的研究对象就是线虫,这是为什么呢?
Mello教授:成年线虫仅有不到一千个细胞,但这些细胞与人体细胞的功能分化非常类似,线虫也有自己的表皮细胞、肌肉细胞和神经细胞,这些结构都是人体结构的微缩版,人体有的细胞线虫基本上也都有与之相匹配的细胞。生物体的结构尽管各种各样,但他们的内部结构非常相似。有趣的是,所有生物体的基因功能如此保守,各种生物体之间的基因功能和作用机制令人难以置信的相似。
线虫是一种简单的生物,我们很容易在实验室对其各种细胞的功能进行研究。线虫从卵到成虫的生长发育过程只需要6天时间,这有利于研究者更快地追踪其各个基因的功能,也使我们的研究周期相应缩短。在人和线虫之间有很多相似之处,我们在线虫中发现了RNAi的机制之后,并不知道在其他物种中是否也存在这种机制,因此我们利用线虫来研究参与RNAi机制的基因。我们首先利用基因敲除技术使参与RNAi机制的基因不能发挥作用(沉默),然后克隆这些线虫的基因,结果发现,这些基因在人的基因组中同样存在,由此我们意识到,这种机制在人体中可能同样也存在。现在人们已经发现这种机制在线虫,人甚至植物等多种生物体内都是存在的。总之,尽管线虫非常小,但其功能复杂,其体内各种复杂的生物学机制可以反映人体内的多种功能,因此值得研究。
论坛报:在您生命中,对您最重要的人和事是什么呢?您获得诺贝尔奖后最想做的事情又是什么呢?
Mello教授:对我最重要的人无疑是我的家人。在获得了诺贝尔奖之后,有很多患者及他们的家属都向我表示,希望能通过RNAi技术治愈他们或他们亲人所患的疾病。我们努力工作试图开发新型技术,来治疗这些可能能够被治疗的疾病,所以在这个领域有很多工作要做,需要花费很多时间。我在美国已开办了一家公司,也可能会在中国开办一家公司来开发RNAi相关药物和技术。当然,我还要尽最大努力继续做更多RNAi方面的实验室研究。
(特别鸣谢中国科学院广州生物医药与健康研究院张必良教授对此次采访的大力支持)
siRNA“沉默”致病基因示意图
秀丽隐杆线虫
责任编辑 林建宏
封面报道
第一次合成的序列共4条：
EGFR
erbB1-1 EGFR:BC094761，328-346
CTCTGGAGGAAAAGAAAGT
erbB1-3 EGFR: BC094761, 539－557
5 -CACAGTGGAGCGAATTCCT-3
HER2
序列1：HER2: NM_001005862，2741－2759
5’-GCATACGTGATGGCTGGTG
序列2：HER2 :NM_004448，410－420
GGAAACCTGGAACTCACCTAC
EGFR+HER2双干扰：EGFR: BC094761,2949-2968
序列3：GTCTACATGATCATGGTCAA；
第二次合成的序列共四条：
HER2-395 M11730，395－415
GCTACGTGCTCATCGCTCACA
HER2-2184 M11730，2184－2204
GCAGCAGAAGATCCGGAAGTA
-erb-b-568 BC094761, 568-588
TGCAGATCATCAGAGGAAATA
-erb-b-2344 BC094761, 2344-2364
CCGTCGCTATCAAGGAATTAA
在吉玛公司发送的构建过程的内容中有下面的阴性和阳性对照序列：
Negatie Control-S:
5'-CACC GTTCTCCGAACGTGTCACGT CAAGAGATT ACGTGACACGTTCGGAGAA TTTTTT G-3'
shhGAPDH-S:
5'-CACC GTATGACAACAGCCTCAAG TTCAAGAGA CTTGAGGCTGTTGTCATAC TTTTTT G-3'
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