【求助】帮忙看看我的2D胶图

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【求助】帮忙看看我的2D胶图-2010-08-31 07:32:19 AM

这是我的胶图。研究的是鸡孵化胚胎肝脏的蛋白质组学，今天跑的胶图成这样了，不是我照的不好，而是酸性端和碱性端确实越往下越向边缘外斜，而且有很重的条纹，是17cmN3-10L的，上样量为120ug，350ul，bio-rad 公司的胶条和聚焦仪，被动水化，用推荐的聚焦程序，试剂都是新配的，但是PAGE电泳液用过一次了，不质是不是这个缘故？还有我再碱性端加的marker液没有出来（点在滤纸片上），以前我也加过，胶图没有倾斜的时候也没有出来，有没有好的方法？我的email是:songmeiling_2001@163.com。请高手指点一下吧，谢谢！
（缩略图，点击图片链接看原图）不知是不是这样，请解答：
1，倾斜变形是不是因为胶凝的速度不一样？加temed后搅拌均匀了不？
2，纵向拖尾是不是DDT没有被平衡掉啊？第二步平衡碘乙酰胺的浓度，平衡的时间是怎么样的？
3，MARKER怎么会不出来？确定点上了？用琼脂糖一起封了？还真想不出什么东西来。
4，PAGE有问题也不会因为你用过一次。感觉像是胶里的什么东西过期了。染色过饱和了.谢谢大家了。今天有做了一块，还是一样。唉。。。。。。
我用平衡液是：尿素 6M
SDS 2%
Tris-Hcl 0.375M(pH 8.8)
甘油 20％
水
平衡液一加0.2g DTT,15ml，平衡液2：加0.25克IAA,10ml,平衡时间都是14min。加TEMED的时候搅拌了。不过我的过硫酸铵时间可能常了，一星期多，难道是这个问题？
Marker我加了，用琼脂糖封了，被挤走了，加在图右边了。
呜。。。。。。，现在好痛苦，好郁闷啊。。。。错了，平衡液1也是10ml，打错了。zebrafishtom是高手，也请园子里的潜水高手说说，我也好像知道答案的。谢谢yfsq了。请大家都说说吧。我的胶条转移的时候与胶的宽度是差不多的，结果出来的时候，左右边空了一片，有可能被挤掉了，也有可能聚焦没聚好，太酸性和碱性的蛋白没跑到点上，但是什么原因呢？我聚焦的时候在酸性端和碱性端都用加了一块滤纸片，在上边点了些DTT，是不是样品的问题呢？这是我的样品处理过程：
裂解液及水化液：10ml
尿素 7M 4.2g
硫脲 2M 1.52g
CHAPS 4% 0.4g
DTT 60mM 0.1g（现加）
IPG-Buffer 0.2% 100ul（20％）（现加）
蛋白酶抑制剂 100ul（现加）
MilliQ水定容至10ml
2.样品处理：液氮研磨成细粉状，装入1.5ml离心管中，加入裂解液1ml，漩涡混匀，冰浴30分，然后室温放置10分钟，然后14000rgm离心1h，取上清。
3.水化和聚焦（17cmNL 3-10）
采用被动水化12小时左右，上样量为120ug，400ul。
聚焦：250 线性 30min
1000 快速 1h
10000 线性 5h
10000 快速 60000H
500 快速 10h
每根胶条限流：50uA
请大家帮忙分析一下吧。可能是二相电泳有点问题，
检查tris ph值，玻璃板，电极液、电泳槽有没有什么异常状况谢谢了首先，上样量有点大了，看你的胶，80-100ug就可以了。
其次，DTT在平衡液中的量可再减小，100mg/10ml平衡液就可以了。DTT过量也会产生竖纹。
另外，跑胶的时候是否没开冷凝水，或胶条两端未与二向SDS胶面贴紧？
且，2DE的electrophoresis buffer不建议重复使用。
供参考，祝实验顺利！挺好的，建议1，调好胶的浓度，2，式样再用clean-up洗一遍，（我们这边是培养细胞洗两遍，临床标本洗一遍）。仅供参考我以前也跑出过类似的图。如果你在跑二向胶条转移前在胶上面加ddH2O，你看看ddH2O会不会渗漏出来。如果漏的话就很容易出现这种情况。二向出问题了，我用的是安玛西压的，伯乐的没用过，如果你是垂直的，肯定上槽与下槽密封不严，有漏电现象，就是说，电流没有全部从凝胶通过。纵向点脱维有可能是DTT/IAA的问题，你的IAA是不是避光有问题啊

发表者QINQIN 时间 2010-08-31 07:32:19 AM

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