【求助】前天跑了张17cm的胶，看着点不多，why？

【求助】前天跑了张17cm的胶，看着点不多，why？

【求助】前天跑了张17cm的胶，看着点不多，why？-2010-08-30 05:47:04 AM

17cm的胶，pH4-7，
聚焦60000hours，
第二向16mA1hour，24mA2.5hours
考染！
为什么点不多呀？二向是不是跑的时间太短了？
看你的图，蛋白上样量太小。可以加大到800微克试试！另外，你的样品碱性蛋白含量较丰富，可考虑结合使用大PH值胶条。从你的图来看,你的样品上样量可以再加大些,聚焦时间再长些,窄胶的上样和聚焦时间都要加大,上样可以上到1克,聚焦至少加大到3-11胶的3倍以上.点多不多和跑2向没什么大的关系！
看你样品可以选择3-10的胶条，没什么太严重的蛋白聚集区！·
但条件要优化！聚焦肯定不好！
看你蛋白点也不规则，样品是新制备的么？若不是最好要保存-80度！
考染的点不少了，就是看着不舒服！在好好查以下原因。
银染怎么样？谢谢几位站友的帮忙。我的样品是半个月前提的，一直保存在-80度，上样量已经1mg了！
以前跑过3次7cm的胶，这是第一次跑17cm的大胶，没有经验，所以还要各位站友帮忙，看看还需要做哪些优化！这里先谢谢了。对了，我们实验室没有扫描仪，这张图像是用Chemidoc XRS拍的，特不清楚！头都大了：（和上量没关系，我一直都用50微克，最少用过20几微克的一点问题都没有。不要浪费标本。几点建议，1，胶再做得好一点，2，细胞裂解液是否过期？3，平衡液Buffer是否过期？二向才3.5个小时,这么快?!汗呀,我们这里一般都是40mA要跑4个小时了.谢谢几位站友的指点。
配置的水化buffer和平衡buffer可以保存多久呢？感觉你的蛋白量好像不是很多。你的蛋白浓度测的准不准啊，你一向上样时速度尽量要快点，温度高了蛋白容易讲解，当天夜里补充覆盖油了吧。再者一向转二向时胶条和分离胶一定接触紧密,排除气泡，否则点也会比较少。你的二向时间太短了，新配置的缓冲液跑的会快些。最好跑5个小时以上。点会跑的更开些.感觉还可以的啊!可以做个3-10的,再银染看看。有些点可能考染染不出来。我也站成事定量的问题

发表者QINQIN 时间 2010-08-30 05:47:04 AM

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