【求助】如何证明A蛋白可以磷酸化B蛋白

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如题，A是一个蛋白激酶，已证明A可以和B结合，免疫共沉淀。如何检测A是否可以磷酸化B。详细的步骤。谢谢。

先提供一种方法供参考：
购买B的磷酸化抗体，用A的质粒转染细胞,质粒分别是激酶失活型的，激酶激活型的，还要野生型的，然后用westenblot方法在转染后的细胞中检测磷酸化的B的蛋白表达情况。
不知是否可选？

在ATP存在时,A+B共反应,然后电泳,磷酸化的蛋白跑的慢.
没磷酸化的在前面.这样就分辨出来了.

feng_bio wrote:
如题，A是一个蛋白激酶，已证明A可以和B结合，免疫共沉淀。如何检测A是否可以磷酸化B。详细的步骤。谢谢。

其实就是激酶活性的检测嘛!
做个体外磷酸化反应,提细胞蛋白,免疫沉淀激酶A,,在含32P-ATP和B的buffer里反应,最终看有没有Phospho-B.
当然也可以不用同位素,现在这方面的试剂盒多了.
化成岩说的也有道理,如果你的蛋白等电点不高的话,可以跑个glycerol-page等不含SDS的,磷酸化和非磷酸化的能分出来。

iris_palm wrote:
其实就是激酶活性的检测嘛!
做个体外磷酸化反应,提细胞蛋白,免疫沉淀激酶A,,在含32P-ATP和B的buffer里反应,最终看有没有Phospho-B.
当然也可以不用同位素,现在这方面的试剂盒多了.
化成岩说的也有道理,如果你的蛋白等电点不高的话,可以跑个glycerol-page等不含SDS的,磷酸化和非磷酸化的能分出来。

不明白您的意思：跑个glycerol-page等不含SDS的,磷酸化和非磷酸化的能分出来。。。是不是跑磷酸化蛋白电泳，配胶方面有什么不同吗？我正想做关于磷酸化及非磷酸化akt 蛋白电泳。。