【专题讨论】细胞培养基中分泌性蛋白的蛋白质组学研究

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细胞培养基中分泌性蛋白的蛋白质组学研究，不知道各位前辈对此有什么建议，有何看法。
贴一篇文献

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第二部分

e example of the myeloid cells secretome.part2.rar (292.97k)

第三部分

e example of the myeloid cells secretome.part3.rar (77.62k)

我个人想法，这是一个很有意思，但操作起来很复杂的课题。如果你要用这个课题作研究，我很赞成久的这很有意思去做做看，如果你想用这个课题作毕业论文的材料的话，望三思而后行。
首先，要解决，你发现的新蛋白是细胞分泌出来的？还是由于各种原因，导致细胞膜破裂，细胞内蛋白流失到培养液中的？再或者干脆是培养液自身带的蛋白？解决了这个问题后，你要面临一个新问题，是否再做蛋白的氨基酸序列的解析。不做，只发表2-D的结果，总是有种未能尽兴，虎头蛇尾的感觉。做，实验室的设备，经费来源问题，够你头痛一阵子的了。
好了，干我们这行的，不要老提钱不钱的，光从技术角度上看，这个课题没问题，可行。用GE公司的2-D电泳系统，我做过几例，很遗憾不能和你共享结果，但我可以说一点结果，如果你有兴趣，做一做也很有意思。我做的是临床肿瘤手术中取下的正常组织和肿瘤组织分别作初代培养。之后从培养液中提取蛋白。与肿瘤组织的相比，正常组织的培养液中蛋白很少。用Cy2,Cy3,Cy5标记后跑2-D，结果是有相当多的蛋白质差异存在，下一步我正打算，增加病例数，做一个统计学验证，仅将有意义的蛋白质提出来，作氨基酸序列的解析。
说的简单，做起来实在是难啊。周期太长，所以你看你的情况，千万别用这个课题作毕业论文的材料。绝对没戏。

我想说：
1、2D的技术已经熟悉。
2、我用的是细胞株，没有临床收集样品的问题。
3、切下来的蛋白点肯定可以进行质谱鉴定，但似乎即使走到这步还是虎头蛇尾 感觉。其实要进一步做出了时间问题，还要看鉴定出来的蛋白点是什么。
4、到现在为止还真没有想到解决你提到的两个问题：其他来源蛋白的干扰、比较出来的差异蛋白点太多而怎么取舍，不知道楼上的除了增加重复次数还用了什么其它的手段不？
谢谢楼上的讨论和忠告：）

我现在在做2种细胞的分泌蛋白，并且要定量比较各种处理的差别，一篇论文已经完成并很快就要投稿。
我的定量方法和大部分实验室不同，我用1D gel 加非标记定量方法。
我在细胞培养液发现770种蛋白，经过分析计算220种蛋白是分泌的。这是现在最大的secretome list. 定量分析发现了30多种差异蛋白,大部分是很有意思的蛋白。

有篇论文专门讲血清蛋白污染问题， 就是用无血清培养液多洗几次就可以。
分析分泌蛋白可以用Go annotation, SignalP, TargetP, THMM分析，基本就可以区分是分泌还是细胞破裂产生的。有几篇论文可以参考。

这是我引用的部分参考文献。

Pellitteri-Hahn, M.C. et al. Improed mass spectrometric proteomic profiling of the secretome of rat ascular endothelial cells. Journal of proteome research 5, 2861-2864 (2006).
28.  Alarez-Llamas, G. et al. Characterization of the Human isceral Adipose Tissue Secretome. Mol Cell Proteomics 6, 589-600 (2007).
29.  Chen, X., Cushman, S.W., Pannell, L.K. & Hess, S. Quantitatie proteomic analysis of the secretory proteins from rat adipose cells using a 2D liquid chromatography-MS/MS approach. Journal of proteome research 4, 570-577 (2005).
30.  Khwaja, F.W. et al. Proteomic identification of the wt-p53-regulated tumor cell secretome. Oncogene 25, 7650-7661 (2006).
31.  Chan, X.C., McDermott, J.C. & Siu, K.W. Identification of secreted proteins during skeletal muscle deelopment. Journal of proteome research 6, 698-710 (2007).
32.  Dupont, A. et al. The proteome and secretome of human arterial smooth muscle cells. Proteomics 5, 585-596 (2005).

谢谢gaobb的回复，更谢谢你的参考文献，一定找出来好好读读。本来只是一个很初步的想法，现在看来是别有洞天了。
有个疑问是：你提到的区分胞内蛋白和分泌蛋白的方法是不是知道该蛋白是什么以后呢？我是想通过实验的手段防止胞内蛋白的污染。看到的文献是通过把培养基中蛋白图谱和胞内蛋白图谱进行比对。个人感觉很是“悬“。不知道各位是怎样处理的。谢谢大家。

我说的是知道蛋白以后然后定位的. 和细胞内蛋白作比较,似乎也是一种方法, 但如果比较分泌蛋白的差别就可以只增加样品量,找到差异蛋白就可以,以为细胞破裂蛋白基本是恒定的,除非处理影响了细胞活性.

"可以只增加样品量,找到差异蛋白就可以,以为细胞破裂蛋白基本是恒定的,除非处理影响了细胞活性", 从理论上讲，似乎是这样子的，处理和对照都有细胞的破裂，应该可以抵消掉这种影响，但从文献来看，蛋白点鉴定量大，结果中胞浆来源的蛋白占很大比例。还有似乎很难用2DE的方法捕捉到真正关键性的一些低丰度调节蛋白。这也许是方法学的限制了。
楼上说得很有意思的蛋白，是说能很好地解释你的处理吗？你这770个蛋白都鉴定出来，花费不是天文数字？
呵呵，不懂，笑话了。

我一直觉得2D胶的方法不是个理想方法。但如果只有MALDI TOF就只能用这种方法。如果有LC-MS/MS， 1D 电泳是比较方便， 如果有LC/LC-MS/MS, 那就用shotgun 的方法。
我用的是1D 电泳，和western做法一样，不过gel 是18X16 cm的，上样量可以到200-400ug, 然后把整条gel切成40个条，所以一个样品就是40个MS/MS样品。我的标本有对照组和处理组，重复3次试验，一共6个样品， 240的MS/MS 样品。 不知道国内40个样品需要多少钱， 我们实验室是900美元。所以一共是5400美元，4万多人民币的样子。 不知道这对你的研究是不是天文数字。 如果经费紧张，我觉得切20条也可以，不做重复试验也可以，大部分蛋白质组实验都没有重复，大概也是经费问题。发现的蛋白或许会少些。
你可以看一下我们具体的protocol:
http://www.natureprotocols.com/2007/03/08/large_scale_itreous_fluid_pro.php

在培养液里是存在很多细胞内蛋白，我的课题发现了28%是分泌的，19%是膜蛋白，另外一篇文章报道70%是分泌+膜蛋白。 但那个研究对分泌蛋白的取舍比较宽松。
不同的细胞细胞在培养时死亡破裂是不同的，我觉得以下方法可以减少细胞内蛋白：
1。在细胞60-70%融合的时间做， 无血清培养时间尽可能缩短，我用24小时，可以试用12小时或8小时，甚至6小时。
2。培养液收了以后要高速离心加0。22um滤膜过滤处理。

谢谢gaobb，头脑变得很清晰了。
个人觉得只是捕捉差异点，还是倾向于2D胶，我不可能对细胞培养基里面的蛋白进行扫描。能做的只是尽一切可能避免各种蛋白的污染，最后选点的时候通过一些手段减少选取污染蛋白的可能。希望有足够的运气 ：）

楼上两位站友，从你们的讨论中受益匪浅，谢谢！
提个可能有些外行的问题：如果在培养液中发现有差异蛋白，通过什么手段能够鉴定该蛋白的结构、属性甚至名称，如果已经明确了这种差异蛋白的分子量，能够达到上述目的吗？花费大吗（比如差异蛋白为数不多，且都已明确了分子量）？

可以用质谱进行鉴定阿，直接把有目的蛋白SDS-PAGE胶送到公司就可以了，600块钱左右，我说的是MALDI TOF。上海有复旦、中科院、基康公司都可以的。给你的结果如果鉴定成功的话包含有蛋白名称、登录号等等，对它的功能注释就比较简单了。中科院电话; 02154975028

谢谢yfsq，妹子不光长得靓丽，还有美丽心灵啊！
表里如一！

实验计划交上去了，如石沉大海，不知道是默认还是忽视，还是放心。反正是没人管。，不管我自己要动手了哦

最近发现了如下一篇文献，仅供参考，或许对你有用
Toward a better analysis of secreted proteins:the example of the myeloid cells secretome， Proteomics 2007, 7, 1757–1770