【求助】蛋白复性与纯化
2010-02-22 05:08:20 PM
【求助】蛋白复性与纯化
出现絮状沉淀是很正常的现象，因为透析本身就是一个复性的过程，那些出现絮状的沉淀就是一些不能够复性成为天然结构的一些目的蛋白和一些杂蛋白，而这些都是我们所不需要的。所以说出现絮状沉淀是正常的也是我们希望看到的。
至于出现沉淀的原因不外乎条件变化太剧烈了，建议不要让透析的条件变化太剧烈了，主要是PH的浓度的变化和样品中一些其他东西如尿素的浓度变化。
如果楼主透析样品中出现太多的沉淀，甚至于跑胶中基本没有带了，那么建议楼主换一种透析液来用，如用TGE也就是传说中的万金油来试试，我一直用的是这种透析液，效果很不错。TGE配法如下：
50mM Tris
0.5mM EDTA
50mM Nacl
5%或10％甘油
如果有条件加入1％的甘氨酸或精氨酸和谷胱甘肽会更好些。
沉淀可以拿来重溶，但是重溶的可行性不大，也就是重新溶解的可能性不大。
以上仅供参考。
先过柱後复性。
蛋白浓度较低可以浓缩一下，浓缩方法有很多，简单一点的可以用PEG包埋，就是将蛋白溶液装在透析袋中，然后覆盖上一些PEG，10～30分钟，根据个体情况而定。
蛋白质的保存，当然最好的是冻干保存，但是如果放置时间不会太长，比如不会超过半年，完全可以放在-80度保存。
包涵体能放置多久？这个问题不知道，包涵体又不是成品蛋白，放置那么久没什么用。
要用TGE反复透析，一般8小时左右换一次透析液，透析三次左右。
PH值要调，一般透析液的PH值要根据等电点来确定。最好距离等电点稍微远点，否则极易产生沉淀。
我用透析法复性蛋白,但出现了好多沉淀,后面我要用Ni柱来纯化,我现在不知道复性后怎么处理?把沉淀弃掉吗?谁来帮帮我吧!
我用透析法复性蛋白,但出现了好多沉淀,后面我要用Ni柱来纯化,我现在不知道复性后怎么处理?把沉淀弃掉吗?谁来帮帮我吧!
首先，可以再多加一点透析液看看能否将之溶掉，这样可以减少由于免疫共沉淀的原因而与杂质一起沉淀的蛋白。
再次如果你的蛋白已经复性，并且能很好的溶解的话，那么沉淀要么是杂质，要么是不能复性的蛋白，我认为可以离心去除。
046 wrote:
我用透析法复性蛋白,但出现了好多沉淀,后面我要用Ni柱来纯化,我现在不知道复性后怎么处理?把沉淀弃掉吗?谁来帮帮我吧!
出现絮状沉淀是很正常的现象，因为透析本身就是一个复性的过程，那些出现絮状的沉淀就是一些不能够复性成为天然结构的一些目的蛋白和一些杂蛋白，而这些都是我们所不需要的。所以说出现絮状沉淀是正常的也是我们希望看到的。
至于出现沉淀的原因不外乎条件变化太剧烈了，建议不要让透析的条件变化太剧烈了，主要是PH的浓度的变化和样品中一些其他东西如尿素的浓度变化。
如果楼主透析样品中出现太多的沉淀，甚至于跑胶中基本没有带了，那么建议楼主换一种透析液来用，如用TGE也就是传说中的万金油来试试，我一直用的是这种透析液，效果很不错。TGE配法如下：
50mM Tris
0.5mM EDTA
50mM Nacl
5%或10％甘油
如果有条件加入1％的甘氨酸或精氨酸和谷胱甘肽会更好些。
沉淀可以拿来重溶，但是重溶的可行性不大，也就是重新溶解的可能性不大。
以上仅供参考。
谢谢您们的回答,我再试试.我还想问一下是先过柱后复性还是先复性后过柱那种方法好?我查资料怎么都不一样.还有我纯化的蛋白浓度比较底,能不能浓缩一下,我后面作免疫动物实验,怎样保存蛋白较好?包涵体能放多久不出现问题?
如透析液用TGE的话,一次透析,还是也要分步,要不要调PH或是浓度?
046 wrote:
谢谢您们的回答,我再试试.我还想问一下是先过柱后复性还是先复性后过柱那种方法好?我查资料怎么都不一样.还有我纯化的蛋白浓度比较底,能不能浓缩一下,我后面作免疫动物实验,怎样保存蛋白较好?包涵体能放多久不出现问题?
先过柱後复性。
蛋白浓度较低可以浓缩一下，浓缩方法有很多，简单一点的可以用PEG包埋，就是将蛋白溶液装在透析袋中，然后覆盖上一些PEG，10～30分钟，根据个体情况而定。
蛋白质的保存，当然最好的是冻干保存，但是如果放置时间不会太长，比如不会超过半年，完全可以放在-80度保存。
包涵体能放置多久？这个问题不知道，包涵体又不是成品蛋白，放置那么久没什么用。
046 wrote:
如透析液用TGE的话,一次透析,还是也要分步,要不要调PH或是浓度?
要用TGE反复透析，一般8小时左右换一次透析液，透析三次左右。
PH值要调，一般透析液的PH值要根据等电点来确定。最好距离等电点稍微远点，否则极易产生沉淀。
谢谢superautumn,你的回答对我很有帮助,以后遇到问题还要想您请教,
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