【求助】WB问题急求救

各位大虾,小弟最近开始做WB,摸了几次条件,现在胶的考染和膜的丽春红上都能看见我的目的条带,我的蛋白是38KD,用地5%的浓缩胶,12%的分离胶,转膜45分钟(湿转).我的一抗(1:1000)4度过夜,二抗(1:1000)室温3-5个小时,ECL发光2分钟,出现的情况是,一次只出来内参,3次暴出来的照片全黑,在暗室看见我的膜上面全是荧光,分不清有条带否.我的膜是0.45微米的.
请问各位大虾我的问题主要出在哪里,是二抗孵育时间过长,还是洗膜时间不够(我洗膜时间是10分钟,5分钟,5分钟).郁闷中,离毕业越来越近,实验一点进展没有,希望得到大家的帮助,再次感谢

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http://www.dxy.cn/bbs/post/iew?bid=65&id=9097241&sty=1&tpg=1&age=0

可以考虑一下情况：
1、二抗浓度太高、孵育时间太长了
2、洗膜不够，可以尝试3次，每次15min
3、如果片子全黑，要考虑胶片是不是已经曝光了，换新的试试
4、可以适当增加一抗浓度
5、封闭情况怎么样