【求助】Ni柱纯化问题

收集细胞后，超声破碎。在上清里加0.2%的Tween20后上柱。然后用pH6.0buffer洗至OD280<0.01,再分别用20mM，40mM咪唑洗，用100、200、300mM洗脱。
问题：
有时候目的蛋白会在20或者40的时候被大量洗脱下来，再将上清上柱两次或者降低流速后这种问题会解决，但是在40－100的咪唑里没有什么蛋白被洗下来，而到了200、300的时候目的蛋白跟一些杂蛋白一起洗脱下来。而且在目的蛋白附近，总是会有一条杂带。
这是什么原因呢？

上清里加入0.2%Tween20 不是必须的吧，我都直接拿上清去结合，然后用20，50，80，200，350，500mM咪唑去洗，一般80mM就能洗去全部杂蛋白

还需要注意样品处理的问题,破碎太剧烈,样品放置时间过长都会导致目标蛋白断裂或者降解,这样杂带就很难去除,此外做的时候需要细致点,多做几个咪唑浓度试试,你缓冲液pH太低也会导致吸附力降低,最好选择7.5-8.5左右再试试.