【求助】急！原来可以表达的蛋白现在诱导表达不出来了。

【求助】急！原来可以表达的蛋白现在诱导表达不出来了。

更多相关内容请访问"医药家园论坛"万人专家团为您在线答疑

我以前的重组菌表达很好。可是现在用冻存的菌株重新做，却没有表达。
提质粒转化后也没有表达。
可是，质粒酶切鉴定却是正确的。
555555，大家帮帮忙拉。

几个可能原因：
1、IPTG是不是失效了啊，这个可以做个正对照
2、感受态细胞失效了，这个也可以做个正对照。
3、做一个pcr test，进一步鉴定。

对于楼主所讲的菌株保存一段时间，表达量下降或消失的现象我们也经常出现,应该是楼主保藏菌种的条件出了问题，可能的原因：甘油浓度过高，带有质粒的重组菌的甘油浓度超过10%会影响质粒稳定性，最好的甘油浓度8%-10%；菌种保藏温度过高，筛选好表达菌种后最好放入-80冰箱或液氮罐中。这时你也可以不重新转化，多挑取几个单克隆做小样表达，如果表达量都很低再转化也不迟。
至于转化后也没有表达而且质粒酶切鉴定是正确的，这个可能是自身操作的原因造成的，如果质粒正确而且转入了表达宿主菌，理论上讲不会出现这种现象的，建议按照yunerwenyu兄所讲，排除操作上的失误。

风采依旧 wrote:
我以前的重组菌表达很好。可是现在用冻存的菌株重新做，却没有表达。
提质粒转化后也没有表达。
可是，质粒酶切鉴定却是正确的。
555555，大家帮帮忙拉。

个别colony问题。

拿出glycerol stock，划一块板，挑5个以上的克隆，pcr筛选，将pcr+克隆全部进行小规模蛋白表达，看看情况是否有好转。如果还是出现原来的情况，那么就提plasmid，测序。

首先谢谢大家！
yunerwenyu提到的原因我也分析过了：
1.IPTG做过阳性和阴性对照，结果正常。
2.感受态细胞也做过阳性对照，正常。
3.PCR是有结果的，之前我已经回收了PCR的片段酶切连接上了。

另外，我已经挑过三次克隆了，每次每板挑8个菌落的。还是不行啊。

我想还是测测序好了。

同意，测序，虽然突变的可能性不大，但是长期保存也不是没有可能。